孫安民，王 偉

（河南省開封市中心醫(yī)院，河南開封475000）

銅綠假單胞菌對假絲酵母菌的影響

孫安民，王 偉

（河南省開封市中心醫(yī)院，河南開封475000）

目的 研究臨床分離的銅綠假單胞菌（PA）對常見假絲酵母菌（包括白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌和葡萄牙假絲酵母菌等）的抑制作用。方法 通過革蘭染色、菌落形態(tài)、氧化酶試驗及上機鑒定收集臨床上120株P(guān)A；通過紙片法檢測PA對常見假絲酵母菌的抑制作用，根據(jù)對假絲酵母菌有無抑制作用將PA分為抑制性PA和非抑制性PA；利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠法（SDSPAGE）對兩組PA進(jìn)行分泌蛋白電泳，觀察電泳條帶的差異；利用共同孵育試驗觀察兩組PA對假絲酵母菌菌絲的抑制作用。結(jié)果 32株P(guān)A為抑制性PA，88株為非抑制性PA；兩組PA分泌蛋白凝膠電泳條帶明顯不同；兩組PA與假絲酵母菌共同孵育后菌絲數(shù)量明顯不同。結(jié)論 部分PA對常見假絲酵母菌有抑制作用，其機制可能是通過抑制菌絲生長和分泌某種蛋白質(zhì)而發(fā)揮作用的。

銅綠假單胞菌；假絲酵母菌；紙片法；抑制作用

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0972）

PA在自然界分布廣泛，是土壤中存在的最常見的細(xì)菌之一。各種水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等處都有PA存在。它是一種條件致病菌，正常情況下一般不致病，當(dāng)條改變時可引起感染，包括創(chuàng)傷后傷口感染、肺炎、腦膜炎、附睪炎、乳突炎、眼部感染和菌血癥等。國內(nèi)外文獻(xiàn)稱，在PA感染的病灶中，極少發(fā)現(xiàn)假絲酵母菌存在。本實驗通過紙片法驗證PA對假絲酵母菌的抑制作用，并通過共同孵育試驗和SDS－PAGE電泳進(jìn)一步探討PA抑制作用的機制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 2012年1月—2013年12月從我院住院及門診患者送檢標(biāo)本中分離出120株P(guān)A，已經(jīng)剔除了重復(fù)菌株，經(jīng)革蘭染色、菌落形態(tài)、氧化酶實驗和Vitek－2全自動微生物鑒定儀對菌株進(jìn)行鑒定。大腸埃希菌ATCC23922、肺炎克雷伯菌ATCC700603和銅綠假單胞菌ATCC25923為質(zhì)控菌株。實驗用的假絲酵母菌為標(biāo)準(zhǔn)菌株：白色假絲酵母菌ATCC10231、熱帶假絲酵母菌ATCC 750、光滑假絲酵母菌ATCC2001、近平滑假絲酵母菌ATCC 22019、克柔假絲酵母菌ATCC 6258、葡萄牙假絲酵母菌ATCC 34449，均由省檢驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1 紙片法 將PA制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，吸?μl均勻涂布于直徑6mm圓形濾紙片上，制成PA濕菌片。在沙保羅培養(yǎng)基上涂布2麥?zhǔn)蠞岫鹊恼婢?，然后貼上PA濕菌片，孵育48h后觀察結(jié)果。

1.2.2 共同孵育實驗 每只無菌EP管中均加入1 ml LB液體培養(yǎng)基，分別將每一株P(guān)A 0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙汉兔恳环N假絲酵母菌2麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙焊?0μl加入EP管中，100r／min離心，30℃搖動孵育24h，取混懸液置顯微鏡下觀察。另取50μL每種假絲酵母菌2麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙杭尤隠B液體培養(yǎng)基中作對照。

1.2.3 SDS－PAGE電泳 將抑制性PA菌株和非抑制性PA菌株作SDS－PAGE分泌蛋白電泳分析。在LB液體培養(yǎng)基中加入0.5麥?zhǔn)蠞岫萈A菌懸液50μl，150r／min離心，35℃搖動孵育24h，取沉淀煮沸10min后直接進(jìn)行SDS－PAGE電泳，染色后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 紙片法結(jié)果 在120株P(guān)A與6種假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)菌株紙片法抑菌試驗中，32株P(guān)A對假絲酵母菌有明顯的抑菌環(huán)，且對每種假絲酵母菌的抑菌環(huán)直徑接近，均在16mm－20mm之間，88株P(guān)A無抑菌環(huán)或抑菌環(huán)不明顯。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC23922和肺炎克雷伯菌ATCC700603均無抑菌環(huán)出現(xiàn)。

2.2 共同孵育實驗結(jié)果 抑制性PA菌株與假絲酵母菌共培養(yǎng)時，假絲酵母菌菌絲顯著減少，甚至不可見，而非抑制性PA菌株與假絲酵母菌共培養(yǎng)時，菌絲數(shù)量明顯多于抑制性PA菌株共同孵育實驗結(jié)果，與對照管相近。見圖1。

圖1 共同孵育實驗（普通光學(xué)顯微鏡×400）

2.3 SDS－PAGE分泌蛋白電泳結(jié)果 抑制性PA菌株和非抑制性PA菌株電泳條帶的共同點是在35 ×103處均有一條深染條帶；不同點是非抑制性PA菌株35×103條帶附近幾乎看不到別的條帶，而抑制性PA菌株35×103條帶附近還顯示幾條顏色較淡的條帶，分別位于24×103處、27×103處和38× 103處，即抑制性PA菌株要比非抑制性PA菌株多出幾個條帶。見圖2。

圖2 SDS－PAGE分泌蛋白電泳

3 討論

PA是廣泛存在于水、土壤、動物體內(nèi)的一種條件致病菌，人們關(guān)注更多的是它的危害性，它可以引起外傷和燒傷創(chuàng)面等多個部位感染，是人類化膿感染中最常見的病原菌之一，僅次于金黃色葡萄球菌；它具有易定植、易變異和多重耐藥的特點，是引起醫(yī)院感染較常見的細(xì)菌。其實它對人體致病的同時也表現(xiàn)出積極的一面，它可以抑制或殺死感染病灶中其它病原微生物，特別是真菌。

本實驗重點研究PA對于假絲酵母菌的抑制作用，國內(nèi)外文獻(xiàn)已有這方面的報道。Hogan等［1］認(rèn)為，PA能在白色假絲酵母菌菌絲表面形成一層厚厚的生物被膜，從而殺死白色假絲酵母菌，也就是說PA抑制或殺滅白色假絲酵母菌是通過影響其菌絲的生長而完成的，與孢子無關(guān)，因為不同酵母菌的孢子細(xì)胞壁存在較大差異；另外，PA的毒力因子（如四型菌毛、吩嗪、磷脂酶C等）也可以抑制或殺死白色假絲酵母菌的菌絲。Kaleli等［2］通過實驗證明，PA對白色假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌的抑制率在血平板和沙保羅培養(yǎng)基上差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Grillot等［3］通過PA與假絲酵母菌純培養(yǎng)及混合培養(yǎng)來調(diào)查PA與假絲酵母菌間的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有被測試假絲酵母菌在血平板和細(xì)菌過濾液中培養(yǎng)時均受到抑制。徐令清等［4］通過實驗得出結(jié)論，PA對大多數(shù)致病性真菌均有抑制作用，主要通過抑制菌絲生長或分泌性蛋白發(fā)揮作用。

根據(jù)本實驗和以上報道，PA對假絲酵母菌抑制作用機理主要有三方面，一是產(chǎn)生多種毒力因子，包括菌毛、莢膜多糖、內(nèi)毒素、外毒素、綠膿菌素、蛋白酶和磷脂酶等，抑制或殺滅假絲酵母菌；二是分泌一種膜狀物，影響菌絲的生長；三是分泌多種特殊蛋白質(zhì)，對假絲酵母菌產(chǎn)生毒害作用。

本實驗顯示，一部分PA對假絲酵母菌有明顯的抑制作用，而另一部分則無抑制作用，與報道部分相符；通過共同培養(yǎng)試驗進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，抑制性PA可以通過干擾假絲酵母菌菌絲生長而發(fā)揮抑制作用，與Hogan等的研究結(jié)果一致；SDS－PAGE蛋白電泳顯示，抑制性PA菌株與非抑制性PA菌株的分泌蛋白條帶存在明顯差異，前者比后者多出2－3個條帶，說明抑制性PA分泌一些特殊蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可能抑制假絲酵母菌的生長，與徐令清等的報道基本相符。

另外還有一些PA抑制其它真菌的報道，Hughes等［5］研究表明，在囊包性纖維癥中超過80%的患者會伴有PA感染，而此疾病很少合并真菌感染，使用廣譜抗菌藥物和類固醇激素治療后，大部分PA被殺死，而往往導(dǎo)致煙曲霉和白色假絲酵母菌感染，PA可能對煙曲霉和白色假絲酵母菌有抑制作用。另有報道［69］稱，PA可以抑制隱球菌的生長。到目前為止，還沒有在囊包性纖維癥患者體內(nèi)分離出隱球菌的報道，隱球菌與PA都是常見的肺部致病菌，如果這二者不能同時定植，那么有可能PA抑制了隱球菌的生長，綠膿菌素可能是抑制囊包性纖維癥患者肺部隱球菌感染的主要原因。

綜上所述，PA在體內(nèi)和體外都具有強大的抗假絲酵母菌活性，原因可能是產(chǎn)生綠膿菌素形成生物被膜，抑制假絲酵母菌菌絲生長；或產(chǎn)生多種細(xì)胞間因子及分泌某些特殊蛋白質(zhì)干擾假絲酵母菌的生理代謝而發(fā)揮抑制作用。我們將進(jìn)一步分離和純化這些物質(zhì)，做進(jìn)一步研究。

［1］Hogan DA，Kolter R.Pseudomonas－Candida interactions：An ecological role for virulence factors［J］.Science，2002，296（5576）：2229.

［2］Kaleli I，Cevahir N，Demir M，et al.Anticandidal activityof Pseudomonas aeruginosa strains isolated from clinicalspecimens［J］.Mycoses，2007，50（1）：74.

［3］Grillot R，Portmann－Coffin V，Ambroise－Thomas P.Growth inhibition of pathogenic yeasts by Pseudomonas aeruginosa in vitro：clinical implications in blood cultures［J］.Mycoses，1994，37（9／10）：343.

［4］徐令清，汪 峰，侯紅艷，等.銅綠假單胞菌對致病真菌的抑制作用［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2014，43（7）：769.

［5］Hughes WT，Kim HK.Mycoflora in cystic fibrosis：some ecologic aspects of Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans［J］.Mycopathol Mycol Appl，1973，50（3）：261.

［6］Rella A，Yang MW，Gruber J，et al.Pseudomonas aeruginosa inhibits the growth of Cryptococcus species.Mycopathologia［J］，2012，173（5－6）：451.

［7］陳 佳，許 東，邢銘友，等.pvdQ基因在銅綠假單胞菌對白假絲酵母菌形態(tài)抑制作用中的功能［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2012，41（1）：12.

［8］Caldwell CC，Chen Y，Goetzmann HS，et al.Pseudomonas aeruginosa exotoxin pyocyanin causes cystic fibrosis airway pathogenesis［J］.Am J Pathol，2009，175（6）：2473.

［9］Rella A，Yang MW，Gruber J，et al.Pseudomonas aeruginosa inhibits the growth of cryptococcus species［J］.Mycopathologia，2012，173（5／6）：451.

Effect of Pseudomonas Aeruginosa on Candida

SUN An－min，WANG Wei.（Laboratory Department，Kaifeng Central Hospital，Kaifeng475000，China）

Objective We investigated the inhibitory effects on common Candida（including Candida albicans，Candida tropicalis，Candida glabrata，Candida parapsilosis，Candida krusei and Portugal Candida）from Pseudomonas aeruginosa（PA）isolated from clinics.Methods We collected 120clinical strains of PA by Gram’s stain，bacterial colony morphology，oxidase production and automated microbial identification system.By sterilizing filter paper－disk method we detected the inhibitory effect of PA on common Candida，according to the inhibitory effect of PA on Candida，we set the PA into inhibitory group and non－inhibitory group.Using sodium dodecyl sulfate－polyacrylamide gel electrophoresis（SDS－PAGE），we made secreted protein electrophoresis on two groups，we observed the differences in electrophoresis bands.By Co－cultured test to observe the inhibitory effect of PA in two groups on Candida hyphae.Results 32strains of PA were inhibitory PA，88strains were non inhibitory PA.In the two groups of PA，the gel electrophoresis of protein bands were obviously different，the number of PA was significantly different after incubation with Candida hyphae.Conclusion Some of PA have inhibitory effect on common Candida，its mechanism may play a role by inhibiting the mycelial growth and secrete some proteins.

Pseudomonas Aeruginosa；Candida；Sterilizing filter paper－disk method；Inhibition

R446.5

A

孫安民（1967－），男，副主任檢驗師，主要從事臨床微生物檢驗。

2014－09－10）

1007－4287（2015）06－0972－03