汪 炎，牛朝詩，3，李仲穎，楊 洋，賀 虎，程傳東，李 靜

膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中Nanog基因啟動子區(qū)甲基化檢測

汪 炎1，2，牛朝詩1，2，3，李仲穎1，2，楊 洋1，2，賀 虎1，2，程傳東1，2，李 靜1，2

目的檢測膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中Nanog基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與Nanog基因的表達(dá)，并探討其在膠質(zhì)瘤發(fā)展中的作用。方法采用甲基化特異性PCR（MSP）法分別檢測正常腦組織、膠質(zhì)瘤組織、膠質(zhì)瘤癌旁組織、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251中Nanog基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，實時定量PCR（RT-PCR）法檢測相應(yīng)組織和細(xì)胞系中Nanog表達(dá)情況。結(jié)果MSP法檢測膠質(zhì)瘤組織Nanog基因啟動子區(qū)呈非甲基化狀態(tài)，且非甲基化檢出率（58.82%）高于癌旁組織（13.63%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝14.852，P＜0.01）。對MSP法檢測結(jié)果行灰度值分析，高級別膠質(zhì)瘤中Nanog基因啟動子區(qū)非甲基化程度高于低級別組。U87和U251細(xì)胞系中Nanog基因啟動子區(qū)呈非甲基化狀態(tài)。RT-PCR結(jié)果顯示高級別膠質(zhì)瘤中Nanog mRNA相對表達(dá)量高于低級別組，U87和U251細(xì)胞系中NanogmRNA的轉(zhuǎn)錄明顯增多。結(jié)論膠質(zhì)瘤中Nanog基因啟動子區(qū)呈非甲基化狀態(tài)，且可能促進(jìn)Nanog基因的轉(zhuǎn)錄，影響膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展。

膠質(zhì)瘤；Nanog；DNA甲基化

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，復(fù)發(fā)率及死亡率高，其發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，探索其發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療措施，一直是神經(jīng)外科的研究重點。Nanog基因是維持胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）自我更新和亞全能性的關(guān)鍵因子，在膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cells，GSCs）中皆呈陽性表達(dá)，促進(jìn)著膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為［1－3］?；騿幼訁^(qū)CpG島的非甲基化狀態(tài)是癌基因激活的一種重要機(jī)制。已有研究［4］表明在生殖細(xì)胞腫瘤中，Nanog基因啟動子區(qū)CpG島呈非甲基化狀態(tài)促進(jìn)Nanog的轉(zhuǎn)錄，維持著腫瘤細(xì)胞未分化的特性。該研究探討人腦膠質(zhì)瘤組織及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中Nanog啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與Nanog基因表達(dá)的關(guān)系，為研究膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展提供可能的分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源選用安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院神經(jīng)外科2012年2月～11月手術(shù)切除膠質(zhì)瘤標(biāo)本51例和相應(yīng)癌旁組織22例。51例膠質(zhì)瘤標(biāo)本術(shù)后經(jīng)病理檢查確診，根據(jù)WHO 2007中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級：Ⅰ級7例，Ⅱ級10例，Ⅲ級16例，Ⅳ級18例。正常腦組織標(biāo)本12例取自顱腦損傷行內(nèi)減壓術(shù)的病患，術(shù)后病理檢查證實均為正常腦組織，無膠質(zhì)細(xì)胞增生和壞死。標(biāo)本取得后于10 min內(nèi)置入－80℃冰箱中冷凍保存。

1.2 細(xì)胞系與主要試劑人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251（中國科學(xué)院上海細(xì)胞所）。細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM／F12、進(jìn)口胎牛血清及胰蛋白酶（美國Gibco公司）；DNA提取試劑盒（中國天根公司）；EZ DNA Methylation Kit（美國ZYMO RESEARCH公司）；Oligod（T）18、Ex Taq DNA聚合酶、Marker D2000、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ?qū)崟r定量試劑盒、Prime-Script RT-PCR Kit、Nanog和GAPDH Real-time PCR引物設(shè)計合成（日本TaKaRa公司）；Nanog甲基化和非甲基化引物合成由上海生工生物公司完成；其他常規(guī)試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251置于10%胎牛血清、100 U／m L青霉素／鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，常規(guī)傳代。

1.3.2 甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（methylationspecific polymerase chain reaction，MSP）

1.3.2.1 DNA提取 使用DNA提取試劑盒，按照說明書操作，分別從膠質(zhì)瘤組織、癌旁組織、正常腦組織及細(xì)胞中提取基因組DNA。使用酶標(biāo)儀（瑞士TECAN Infinite200）測定提取DNA樣本的純度和濃度。

1.3.2.2 DNA甲基化修飾 每份標(biāo)本取5μg DNA作為模板，加ddH2O至20μl。使用EZ DNAMethylation Kit試劑盒，對樣本進(jìn)行亞硫酸鹽處理并純化，甲基化修飾后的DNA保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.3 PCR擴(kuò)增 以甲基化修飾后的DNA為模板，分別用Nanog基因啟動子區(qū)特異甲基化和非甲基化引物行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，ddH2O替代DNA樣本作為陰性對照。引物設(shè)計參考文獻(xiàn)［5］，其中甲基化引物序列：5′-TTAATTTATTGGGATTATAGGGGTG-3′（上游），5′-AAACCTAAAAACAAACCCAACAAC-3′（下游），非甲基化引物序列：5′-ACTGTCTCTCCTCTTCCCTC-3′（上游），5′-CCTGTTTGTAGCTGAGGTTC-3′（下游）。PCR反應(yīng)體系（10μl）：cDNA模板1 μl，上下游引物各0.5μl，Ex Taq DNA聚合酶5μl，ddH2O 3μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min后，94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1min，共35個循環(huán)，72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物10μl置于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，采用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行凝膠成像，Quantity One軟件行灰度值分析。

1.3.3 Real-time PCR檢測Nanog表達(dá) TRIzol-氯仿-異丙醇法提取膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中的總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在美國ABI Prism 7500快速實時定量PCR儀上進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，條件：95℃預(yù)變性30 s后，95℃變性5 s，60℃退火延伸34 s，共35個循環(huán)。反應(yīng)體系（20μl）：cDNA模板2μl，上下游引物各0.8μl，SYBR Premix EX TaqTMⅡ（2×）10 μl，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μl，ddH2O 6 μl。所有樣品設(shè)3個復(fù)孔。記錄每個反應(yīng)管中的熒光信號達(dá)到閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，得到Nanog的相對表達(dá)量。Nanog上游引物：5′-CCTGTGATTTGTGGGCCTGA-3′，下游引物：5′-CTCTGCAGAAGTGGGTTGTTTG-3′，片段大小為168 bp。GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，片段大小為138 bp。PCR結(jié)果判斷：ΔCt＝Ct目的基因－Ct內(nèi)參，ΔΔCt＝（Ctnanog－Ctgapdh）高級別－（Ctnanog－Ctgapdh）低級別，RQnanog＝2－ΔΔCt［6］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用兩獨立樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤組織中Nanog基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)Nanog基因啟動子區(qū)甲基化引物和非甲基化引物擴(kuò)增片段長度分別為213 bp和225 bp。51例膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，30例標(biāo)本檢測出Nanog基因啟動子區(qū)呈非甲基化狀態(tài)，而22例癌旁組織中僅有3例檢測出非甲基化，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝14.852，P＝0.000）。正常腦組織中未檢測出非甲基化的表現(xiàn)。Nanog啟動子區(qū)非甲基化率在膠質(zhì)瘤WHOⅠ級、WHOⅡ級、WHOⅢ級、WHOⅣ級標(biāo)本中分別為42.9%（3／7）、50.0%（5／10）、62.5%（10／16）、66.7%（12／18），各病理級別之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝1.605，P＝0.658）。對目的條帶行灰度值分析，Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤的灰度值明顯高于Ⅰ～Ⅱ級膠質(zhì)瘤（t＝6.988，P＝0.000）。Nanog啟動子區(qū)非甲基化程度隨著膠質(zhì)瘤病理級別的增加而升高。見圖1。

2.2 膠質(zhì)瘤組織中Nanog啟動子甲基化和其mRNA表達(dá)的關(guān)系Nanog和GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線顯示均為單峰，表明擴(kuò)增產(chǎn)物單一，無非特異性擴(kuò)增；擴(kuò)增曲線顯示Nanog呈指數(shù)增長，并進(jìn)入平臺期，表明擴(kuò)增效率高。見圖2、3。Nanog啟動子區(qū)非甲基化陽性的30例標(biāo)本中檢測出28例發(fā)生Nanog的轉(zhuǎn)錄，而未發(fā)生非甲基化的21例中有15例檢測出Nanog的轉(zhuǎn)錄，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝4.482，P＝0.034）。癌旁組織和正常腦組織中均未檢測出Nanog的表達(dá)。以GAPDH為內(nèi)參、低級別中Nanog表達(dá)量為基準(zhǔn)，低級別和高級別膠質(zhì)瘤中Nanog的相對表達(dá)量分別為（1.24±0.61）、（4.53± 0.91），高級別膠質(zhì)瘤Nanog表達(dá)相對于低級別膠質(zhì)瘤明顯升高（t＝11.41，P＝0.00）。見圖4。

2.3 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中Nanog啟動子甲基化和其mRNA表達(dá)的關(guān)系MSP法檢測顯示U87、U251細(xì)胞系中Nanog啟動子區(qū)非甲基化引物擴(kuò)增出目的條帶，而甲基化引物未擴(kuò)增出條帶。說明U87、U251細(xì)胞系中Nanog啟動子區(qū)呈非甲基化狀態(tài)。Realtime PCR結(jié)果顯示，在U87、U251細(xì)胞系中發(fā)生了Nanog基因的轉(zhuǎn)錄。見圖5。

3 討論

Nanog是近年來在ESCs內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一個重要轉(zhuǎn)錄因子，該因子對維持ESCs的自我更新及亞全能性起著關(guān)鍵作用，是全能性或多能性干細(xì)胞標(biāo)志物［6］。本課題組前期研究［1－3］顯示，Nanog在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)并隨著病理級別的增高其表達(dá)增多；在GSCs中Nanog亦呈高表達(dá)，且顯著高于U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，表明Nanog是一種與分化緊密相關(guān)的重要調(diào)節(jié)因子，并作為候選癌基因調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為。

腫瘤是由于表觀遺傳和遺傳異常共同作用，導(dǎo)致基因表達(dá)失調(diào)而發(fā)生的。表觀遺傳學(xué)包括組蛋白修飾、RNA干擾、DNA甲基化、染色質(zhì)重塑等，精確調(diào)控著基因表達(dá)，而不改變基因的序列［7］?；騿幼訁^(qū)CpG島的呈現(xiàn)出非甲基化狀態(tài)是激活癌基因的一種重要機(jī)制。Nanog啟動子區(qū)散在分布著組織依賴差異的DNA甲基化區(qū)域（T-DMR）。T-DMR在ESCs中非甲基化，使Nanog得以表達(dá)，而在滋養(yǎng)層干細(xì)胞（trophoblast stem cells，TSCs）中呈高甲基化，使Nanog表達(dá)失活［8］。在胚胎癌細(xì)胞中Nanog啟動子區(qū)CpG位點未發(fā)生DNA甲基化，而在293T細(xì)胞中有67%甲基化，將293T用胚胎癌提取物處理4周后，甲基化的CpG位點下降到39%［9］。Nettersheim et al［4］發(fā)現(xiàn)在生殖細(xì)胞腫瘤中OCT4與SOX2介導(dǎo)的Nanog表達(dá)可以被Nanog啟動子區(qū)CpG島的高甲基化所沉默，并且發(fā)現(xiàn)生殖細(xì)胞腫瘤的分化狀態(tài)與Nanog啟動子區(qū)CpG島的甲基化程度密切關(guān)聯(lián)。

本研究顯示，腦膠質(zhì)瘤中Nanog啟動子區(qū)非甲基化率明顯高于癌旁組織和正常腦組織，表明Nanog啟動子區(qū)非甲基化在膠質(zhì)瘤中是一個頻發(fā)事件且有著顯著的腫瘤特異性。非甲基化陽性組中NanogmRNA的表達(dá)明顯高于陰性組，高級別膠質(zhì)瘤中Nanog啟動子區(qū)非甲基化程度高于低級別組，NanogmRNA的轉(zhuǎn)錄水平亦明顯升高，前期的免疫組化和Western blot結(jié)果顯示，Nanog的蛋白表達(dá)強(qiáng)度隨著膠質(zhì)瘤組織的病理級別的升高而增強(qiáng)，提示Nanog啟動子區(qū)非甲基化是導(dǎo)致Nanog蛋白表達(dá)增強(qiáng)的重要機(jī)制［1］。Nanog啟動子區(qū)在U87、U251細(xì)胞系中皆呈非甲基化狀態(tài)，且在U87、U251細(xì)胞系亦檢測到Nanog基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步證明Nanog啟動子區(qū)非甲基化狀態(tài)促進(jìn)Nanog的表達(dá)，維持腫瘤細(xì)胞的低分化或未分化狀態(tài)。

本實驗中擴(kuò)增的Nanog啟動子區(qū)片段是位于其轉(zhuǎn)錄起始位點上游－200 bp區(qū)域，此區(qū)域中包含著與轉(zhuǎn)錄因子Oct4／Sox2的結(jié)合位點（－104 bp～－108 bp）［7］，對Nanog的調(diào)控起著重要作用。有研究者利用電泳遷移變動分析和染色質(zhì)免疫共沉淀實驗證明，Oct4和Sox2確實能在體外和體內(nèi)結(jié)合到Nanog的啟動子上［18］。對該位點進(jìn)一步的誘變分析表明，Oct4／Sox2對于Nanog啟動子活性是必不可少的，并能在多能性細(xì)胞中提高Nanog的轉(zhuǎn)錄。結(jié)合本研究結(jié)果，在膠質(zhì)瘤中該區(qū)域的CpG島呈非甲基化狀態(tài)，更有利于Oct4、Sox2與Nanog啟動子區(qū)的結(jié)合，促進(jìn)Nanog的表達(dá)。

綜上所述，人腦膠質(zhì)瘤中Nanog基因啟動子區(qū)非甲基化模式與Nanog的表達(dá)有著密切的相關(guān)性。通過改變膠質(zhì)瘤中Nanog啟動子區(qū)原有甲基化模式，是否能夠下調(diào)Nanog的表達(dá)從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)活性還有待進(jìn)一步研究。

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Analysis and significance of Nanog promoter methylation status in gliomas and gliom a cells

Wang Yan1，2，Niu Chaoshi1，2，3，Li Zhongying1，2，et al
（1Dept of Neurosurgery，The Affiliated Provincial Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230001；2Anhui Province Key Laboratory of Brain Function and Brain Disease，Hefei 230001；3Anhui Provincial Stereotactic Neurosurgical Institute，Hefei 230001）

Objective To detect themethylation status of Nanog gene promoter and the expression of NanogmRNA in gliomas and glioma cell lines，and to explore the function of Nanog in glioma.MethodsMSP and RT-PCR were conducted to detect Nanog gene promoter′smethylation statusand itsmRNA expression in normal brain tissues，glioma tissues，paracancerous tissues，glioma cell lines U87 and U251.ResultsNanog gene promoter was hypermethylated in gliomas，and the presence was significantly higher in gliomas than that in the paracancerous tissues（58.82%vs13.63%）（χ2＝14.852，P＜0.01）.Nanog gene promoter unmethylation state was higher in gradeⅢand gradeⅣglioma compared with grade Iand gradeⅡtumors.Nanog gene promoterwas hypermethylated in U87 and U251 cell lines.Nanog mRNA expression levels in high-grade（Ⅲ＋Ⅳ）gliomas were higher than the lowgrade（I＋Ⅱ）group，NanogmRNA expression was significantly increased in U87 and U251 cell lines.ConclusionUnmethylation state of Nanog gene promoter regions is one of themost importantmechanisms thatup-regulate its protein expression and influence the occurrence and development of gliomas.

glioma；Nanog；DNA methylation

R 739.41

A

1000－1492（2015）08－1068－04

2015－04－22接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81172407）；安徽省重點實驗室績效考核項目（編號：1306c083028）

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院1神經(jīng)外科、2腦功能與腦疾病安徽省重點實驗室、3安徽省腦立體定向神經(jīng)外科研究所，合肥 230001

汪 炎，男，碩士研究生；

牛朝詩，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：niuchaoshi＠163.com