許士進，何淑芳，金世云，胡 軍，張 野

利用定量加壓充氣球囊制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型

許士進，何淑芳，金世云，胡 軍，張 野

雄性SD大鼠隨機分為3組，每組20只：假手術(shù)組（SHAM組）、球囊缺血再灌注組（SI／R組）、經(jīng)典缺血再灌注組（I／R組）。3組均在冠狀動脈左前降支下穿線，SHAM組僅將未充氣的球囊固定于穿線處；SI／R組固定球囊后，通過加壓泵對球囊充氣和放氣建立缺血再灌注損傷模型；I／R組采用傳統(tǒng)的造模方法。記錄血流動力學和心電圖的特異性改變，再灌注2 h后取心臟進行TTC染色測心肌梗死面積。結(jié)果顯示，SI／R和I／R組均可造成顯著心肌缺血，兩組死亡率和心肌梗死體積（IS／ARR）的差異無統(tǒng)計學意義。

動物模型；心臟；缺血再灌注；充氣；球囊

心肌缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是指心肌組織在經(jīng)歷較長時間缺血后，當恢復血流灌注時反而使心肌缺血后損傷加重的病理生理現(xiàn)象［1］。心肌IRI的防治及機制研究已成為目前心血管領(lǐng)域的熱點問題。大鼠以其冠狀動脈側(cè)支循環(huán)少、心肌壞死出現(xiàn)早、重復性、穩(wěn)定性好，成為制作心肌IRI模型的首選實驗動物［2］。目前制備大鼠心肌IRI的經(jīng)典方法為推管法［3］，但反復推管操作易損傷心肌和冠狀血管，且無法滿足核磁共振（MRI）成像［4］、心肌灌注斷層顯像［5］等新技術(shù)在進行動物心肌IRI研究時對實時、遠程操控的要求。該研究利用定量加壓充氣球囊制備心肌IRI模型，并可通過與延長管連接實施實時遠程操作，模型成功率高、損傷小、操作方便。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6～8周齡健康雄性清潔級SD大鼠60只，200～300g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。室內(nèi)溫度20～25℃。

1.2 主要試劑戊巴比妥鈉（使用濃度為3%，生理鹽水溶解，由安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院中心實驗室提供）；伊文斯蘭（批號：20110909024，北京綠生源有限公司，使用濃度0.25%，生理鹽水溶解）；氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium，TTC，批號：129K1867V，美國Sigma公司，使用濃度為100 mmol／L，溶于磷酸鹽緩沖液pH＝7.4）。

1.3 主要儀器動物呼吸機（ALC-V9型，上海奧爾科特生物科技有限公司）；生物機能系統(tǒng)（BL-420S型，成都泰盟生物科技有限公司）。

1.4 定量加壓充氣球囊采用尼龍（PA 12）材料，通過料管拉伸、球囊成型、前端封頭等技術(shù)制成直徑4 mm、長度15 mm的可擴充球囊，通過與球囊連接的延長管利用定量加壓泵給球囊加壓充氣（球囊委托江蘇常美醫(yī)療器械有限公司定制，定量加壓泵由安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院介入科提供）。

1.5 方法

1.5.1 實驗分組與處理 將雄性SD大鼠隨機分為3組，每組20只：假手術(shù)組（SHAM組）、球囊缺血再灌注組（SI／R組）、經(jīng)典缺血再灌注組（I／R組）。大鼠用3%的戊巴比妥2 ml／kg腹腔注射，麻醉后仰臥固定于鼠板上，連接生物機能實驗系統(tǒng)，記錄心電圖。氣管切開，置入氣管導管，連接小動物呼吸機，潮氣量3 m l／100 g，頻率60～80次／min。頸內(nèi)動脈穿刺置管，連接壓力傳感器，測動脈血壓。股靜脈穿刺置管，用微量泵進行補液［乳酸鈉林格氏液0.1 ml／（kg·h）］。于胸骨左側(cè)約0.5 cm，第3、4肋間處打開胸腔，無齒鑷撕破心包膜，使心臟充分暴露。在左心耳與肺動脈圓錐之間找到與左冠狀動脈伴行的心大靜脈，在左心耳下方2 mm處以5－0無損傷縫合針穿線，進針深度為1.0～1.5 mm，寬度為2～3 mm。SHAM組穿線后，用結(jié)扎線將未充氣的球囊松緊適宜的固定于穿線處，且不影響冠脈血流，整個實驗過程中不對球囊進行充氣。SI／R組穿線后，用結(jié)扎線將未充氣的球囊松緊適宜的固定于穿線處，穩(wěn)定20 min后，用與球囊相連的定量加壓泵對球囊進行快速充氣，使球囊壓力迅速達到并固定于200 kPa，此時擴張的球囊壓迫冠狀動脈，阻斷動脈血流，造成缺血；缺血30 min后，通過加壓泵迅速抽盡球囊氣體，恢復冠脈血流。I／R組在穩(wěn)定20min后，用推管法結(jié)扎冠狀動脈，即將結(jié)扎線的兩端通過一硬塑管，用血管鉗向下推動硬塑管壓向冠狀動脈，夾緊結(jié)扎線阻斷冠脈血流；缺血30 min后，松開結(jié)扎線實現(xiàn)再灌注。

1.5.2 血流動力學檢測 分別記錄各組在穩(wěn)定20 min后（基礎(chǔ)值），缺血30 min后和再灌注2 h后的心率（heart rate，HR）和平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP），計算HR和MAP乘積（rate pressure product，RPP）。

1.5.3 心肌梗死面積檢測 再灌注2 h后，取出心臟，剔除非心臟組織，置于Langendorff上用K－H液灌注5 min（37℃），沖洗出心肌內(nèi)殘留血液，重新結(jié)扎左冠狀動脈，并從主動脈注入0.25%Evan藍溶液，后置于－80℃冰箱速凍1～2 h。將冰凍的心臟放入心肌切槽，由心尖到結(jié)扎冠脈的線結(jié)處平切2 mm厚的心肌5～6片。置于1%TTC溶液中，37℃（pH＝7.4）溫孵15 min，取出置于10%福爾馬林室溫固定12 h。染色后缺血危險區(qū)呈紅色，梗死區(qū)為白色，用圖像分析軟件（Imaging J 1.38e）計算左心室體積（left ventricle，LV）、右心室體積（right ventricle，RV）、缺血危險區(qū)體積（area at risk，AAR）和梗死區(qū)體積（infarct size，IS），再算出LV＋RV，用IS／AAR表示心肌梗死體積。

1.6 統(tǒng)計學處理采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK分析；血流動力學數(shù)據(jù)采用重復測量資料的方差分析；死亡率比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 死亡率比較SHAM組20只大鼠均存活，SI／R組20只大鼠中有1只大鼠于缺血時因心律失常死亡，2只大鼠于再灌注時因心力衰竭死亡；I／R組20只大鼠中有2只大鼠于缺血時因心律失常死亡，2只大鼠于再灌注時因心力衰竭死亡。SI／R組和I／R組相比死亡率差異無統(tǒng)計學意義（0.15 vs 0.20，χ2＝0.173，P＞0.05）。

2.2 心肌血供和心電圖ST段變化情況心臟直視下，SHAM組手術(shù)前后心肌血供無明顯變化；SI／R組和I／R組在冠狀動脈左前降支結(jié)扎后，左室前壁紫紺，再灌注后紫紺消失。SHAM組手術(shù)前后心電圖無明顯變化；SI／R組和I／R組在冠狀動脈左前降支結(jié)扎后QRS波群增寬、ST段均較結(jié)扎前明顯抬高。見圖1。且SI／R組和I／R組均在缺血后10 min左右及再灌注即刻出現(xiàn)明顯的心律失常，以一過性室性早搏、室性心動過速為主。

2.3 血流動力學指標與基礎(chǔ)值相比，SI／R組在缺血30 min和再灌注2 h時的MAP和RPP以及I／R組在缺血30 min和再灌注2 h時的MAP和RPP均顯著降低（F＝21.540、10.488、35.975、16.534，P＜0.01）；與SHAM組相比，SI／R組在缺血30 min和再灌注2 h時的MAP和RPP以及I／R組在缺血30 min和再灌注2 h時的MAP和RPP也顯著降低（F＝21.148、10.810、15.449、7.949，P＜0.01）。見表1。

表1 血流動力學指標，n＝20）

表1 血流動力學指標，n＝20）

與基礎(chǔ)值比較：**P＜0.01；與SHAM組比較：＃＃P＜0.01

項目SHAM組SI／R組I／R組HR（次／min）基礎(chǔ)值369±30 365±29 361±29缺血30min 360±31 350±32 347±26再灌注2 h 356±28 337±29 340±23 MAP（kPa）基礎(chǔ)值12.786±1.33 12.369±1.064 12.768±1.064缺血30min 12.369±1.197 8.645±0.931**＃＃9.443±1.197**＃＃再灌注2 h 11.837±0.532 9.842±0.798**＃＃10.374±0.931**＃＃RPP［kPa／（min·1 000）］基礎(chǔ)值4.655±0.798 4.522±0.665 4.655±0.798缺血30min 4.522±0.798 2.926±0.532**＃＃3.325±0.665**＃＃再灌注2 h 4.256±0.532 3.325±0.532**＃＃3.458±0.532**＃＃

2.4 心肌梗死體積測定各組間比較，LV＋RV、AAR體積差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。SHAM組未見梗死。與I／R組相比，SI／R組的IS體積（cm3）（0.26±0.05 vs 0.27±0.04，P＞0.05）和IS／AAR（0.491±0.083 vs 0.506±0.091，P＞0.05）比較差異均無統(tǒng)計學意義。見圖2。

3 討論

冠狀動脈左前降支是左心供血的最主要血管，結(jié)扎后可導致室間隔、左室前壁心肌缺血、梗死，因此成為研究心肌IRI最常用的血管。隨著對心肌IRI研究的不斷深入，以及新技術(shù)的應用，對心肌IRI的造模方法也提出了新的要求。

以往的大鼠心肌IRI的造模方法主要可歸納為壓管法［6］和推管法［3］兩大類，然而以上兩種方法在“壓管”和“推管”時，所用的硅膠管和硬塑管均與心臟表面接觸，大鼠心臟搏動時，管與心臟摩擦，易損傷心臟和血管。目前缺血預處理［7］以及后處理［8］對抗IRI的機制研究已成為心肌保護研究的重點和熱點。然而傳統(tǒng)方法在進行預處理和后處理時均需在胸腔內(nèi)反復進行結(jié)扎與再灌注的操作，不僅費時費事，影響模型復制的成功率，而且會加重對心臟及冠脈的損傷。本實驗采用定量加壓充氣球囊復制大鼠心肌IRI模型，充氣后可見大鼠心肌左室前壁迅速紫紺，心電圖ST段明顯抬高；再灌注后紫紺迅速消失，出現(xiàn)明顯的心律失常。兩者的死亡率及心肌梗死面積差異無統(tǒng)計學意義。以上結(jié)果表明球囊法是一種穩(wěn)定可靠的復制大鼠心肌IRI的方法，且和傳統(tǒng)的壓管法及推管法相比，操作簡便，對心臟及冠脈損傷小，通過與球囊相連的定量加壓泵可實現(xiàn)球囊的快速充氣和放氣，有利于進行預處理及后處理等相關(guān)操作，并可固定球囊壓力實現(xiàn)實驗操作的量化。

近年來，核磁共振掃描［9］、心肌灌注斷層掃描［10］等新技術(shù)已經(jīng)越來越多地應用于動物實驗的研究。然而，傳統(tǒng)的造模方法已無法適應這些新技術(shù)對于IRI模型制備過程中實時及遠程操控的要求。Pohlmann et al［9］利用與腎動、靜脈固定在一起的注水球囊制備腎臟IRI模型，從而獲得了腎臟在缺血再灌注過程中的實時功能MRI圖像。趙秀梅等［11］和周汝娟等［12］先后成功利用球囊墊扎法制作大鼠心肌IRI模型，但實驗中使用的球囊均為醫(yī)用冠狀動脈成形術(shù)的球囊導管，價格昂貴，或回收使用易致交叉感染；此外，這類球囊內(nèi)均含有金屬標記物，不能用于高磁場環(huán)境。本實驗使用定制的定量加壓充氣球囊，制作成本低，質(zhì)量可靠，可以成功制備大鼠心肌IRI，適合用于動物實驗研究。通過在球囊與加壓泵之間添加延長連接管，可以實時、遠程實施缺血再灌注或預處理操作，將會滿足在普通或MRI、斷層掃描等特殊實驗條件下進行動物IRI研究的要求。

［1］ Yellon DM，Hausenloy D J.Myocardial reperfusion injury［J］.N Engl JMed，2007，357（11）：1121－35.

［2］ 饒先偉，葉澤兵.人參皂苷Rg2后處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其機制［J］.現(xiàn)代醫(yī)院，2013，13（8）：18－20.

［3］ Zhang Y，Irwin M G，Wong T M.Remifentanil preconditioning protects against ischemic injury in the intact rat heart［J］.Anesthesiology，2004，101（4）：918－23.

［4］ Zhao F，Williams M，Meng X，et al.Pain fMRI in rat cervical spinal cord：an echo planar imaging evaluation of sensitivity of BOLD and blood volume-weighted fMRI［J］.Neuroimage，2009，44（2）：349－62.

［5］ Mewton N，Rapacchi S，Augeul L，et al.Determination of the myocardial area at risk with pre-versus post-reperfusion imaging techniques in the pigmodel［J］.Basic Res Cardiol，2011，106（6）：1247－57.

［6］ 劉付平，姚宏偉，李 俊.大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的改進［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2003，38（3）：234－36.

［7］ Yang X，Cohen M V，Downey JM.Mechanism of cardioprotection by early ischemic preconditioning［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2010，24（3）：225－34.

［8］ Buelna-Chontal M，Guevara-Chávez JG，Silva-Palacios A，et al. Nrf2-regulated antioxidant response isactivated by protein kinase C in postconditioned rat hearts［J］.Free Radic Biol Med，2014，74：145－56.

［9］ Pohlmann A，Hentschel J，F(xiàn)echner M，etal.High temporal resolution parametric MRImonitoring of the initial ischemia／reperfusion phase in experimental acute kidney injury［J］.PloS One，2013，8（2）：e57411.

［10］Mahnken A H，Klotz E，Pietsch H，et al.Quantitative whole heart stress perfusion CT imaging as noninvasive assessment of hemodynamics in coronary artery stenosis：preliminary animal experience［J］.Invest Radiol，2010，45（6）：298－305.

［11］趙秀梅，孫 勝，劉秀華.墊扎球囊法復制大鼠在體心肌缺血／再灌注模型［J］.中國微循環(huán)，2007，11（3）：206－8.

［12］周汝娟，王修珍.球囊墊扎法實施缺血后適應對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用［J］.蚌埠醫(yī)學院學報，2012，37（8）：880－3.

AbstrsctAdultmale SD rats were randomly divided into three groups，20 rats in each group：Sham operation group（SHAM group），saccule ischemia-reperfusion group（SI／R group），classical ischemia-reperfusion group（I／R group）.A 5-0 silk tread was passed around the left anterior descending coronary artery of ratheart in all of the three groups.In SHAM group，the saccule was fixed on the artery without inflation.In SI／R group，the fixed saccule was inflated and then deflated to inducemyocardium ischemia and reperfusion by using a pressure pump.In I／R group，the classicalmethod was used to establish themodel.Hemodynamic parameters and electrocardiographic changeswere recorded during the experiment.Infarctsize（IS），as a percentage of the area at risk（AAR），was determined by 2，3，5-triphenyltetrazolium（TTC）staining at the end of reperfusion.The results showed regional ischemia was induced in both SI／R and I／R groups，and there was no statistically significant difference between SI／R and I／R groups regarding animalmortality and infarct size（IS／ARR）.

Establishment of ratmodel ofmyocardial ischem ia-reperfusion injury by using a quantitative inflating saccule

Xu Shijin，He Shufang，Jin Shiyun，etal
（Dept of Anesthesiology，The Second Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230601）

animalmodel；heart；ischemia-reperfusion；inflation；saccule

R 654.2；R-332

A

1000－1492（2015）08－1180－04

2015－04－14接收

國家自然科學基金（編號：81471145）

安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院麻醉科，合肥 230601

許士進，男，碩士研究生；

張 野，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，責任作者，E-mail：zhangye＿hassan＠sina.com