石靜 梁勇剛

【摘要】目的：研究穿心蓮內(nèi)酯誘導(dǎo)人HL-60細(xì)胞凋亡及相關(guān)機(jī)制。 方法：以人早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60為模型，作用于HL-60細(xì)胞的穿心蓮內(nèi)酯設(shè)3125、625、125μg/ml三個(gè)受試濃度，實(shí)驗(yàn)分為溶媒對照組、穿心蓮內(nèi)酯3125μg/ml、625μg/ml、125μg/ml四個(gè)組。采用Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合熒光染色檢測穿心蓮內(nèi)酯對細(xì)胞色素C（CytC）蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：穿心蓮內(nèi)酯能促進(jìn)HL-60細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性。穿心蓮內(nèi)酯作用HL-60細(xì)胞24h，CytC蛋白表達(dá)增加，125μg/ml作用濃度與溶媒對照相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。結(jié)論：穿心蓮內(nèi)酯能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)凋亡機(jī)制可能與CytC釋放的增加、線粒體通路有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 穿心蓮內(nèi)酯；細(xì)胞凋亡； CytC

【中圖分類號】R2855【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2015）03-0022-02

1材料和方法

11細(xì)胞購置及培養(yǎng)人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞株購于武漢大學(xué)細(xì)胞保存中心。用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基放置在常規(guī)培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

12樣品配置及實(shí)驗(yàn)分組根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作用于HL-60細(xì)胞的穿心蓮內(nèi)酯（購自天津天士力制藥股份有限公司）設(shè)3125、625、125μg/ml 3個(gè)受試濃度。用DMSO溶解穿心蓮內(nèi)酯為50mg/ml貯存液，所需濃度在實(shí)驗(yàn)前用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋生成。實(shí)驗(yàn)分為溶媒對照組、穿心蓮內(nèi)酯3125μg/ml、625μg/ml、125μg/ml四個(gè)組。

13流式細(xì)胞儀檢測穿心蓮內(nèi)酯作用HL-60細(xì)胞24h凋亡率把對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/ml，以1ml/孔接種于6孔板內(nèi)，加入不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯，作用24h后離心收集細(xì)胞，PBS液洗滌細(xì)胞兩次，按照Annexin V/PI雙染法（試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司）步驟操作，1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用WinMDI version29軟件進(jìn)行分析。

14熒光標(biāo)記/流式細(xì)胞術(shù)檢測Cytc蛋白的表達(dá)細(xì)胞的培養(yǎng)、接種、加樣品同上。穿心蓮內(nèi)酯作用HL-60 24h后收集細(xì)胞，800rpm離心5min后，用250μl PBS液清洗2次后重懸細(xì)胞于流式管中，加入20μl熒光標(biāo)記的Cytc（購自Abzoom公司），上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 115統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，用x±SD表示所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，P<005為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

31穿心蓮內(nèi)酯作用HL-60細(xì)胞24h凋亡定量檢測結(jié)果顯示，和溶媒對照相比，穿心蓮內(nèi)酯各濃度作用于HL-60 24h后，各組細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率及壞死率均隨著穿心蓮內(nèi)酯濃度的升高逐漸升高，量效關(guān)系明顯；與溶媒對照相比，中、高濃度早期凋亡率、晚期凋亡率及壞死率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。見表1。

32穿心蓮內(nèi)酯作用HL-60細(xì)胞24h CytC蛋白表達(dá)變化結(jié)果表明，與溶媒對照相比，不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯作用HL-60細(xì)胞24h后，CytC蛋白表達(dá)逐漸增加，表明穿心蓮內(nèi)酯作用后CytC從線粒體膜間隙釋放到胞漿內(nèi)的量逐漸增加。

4討論

惡性腫瘤是威脅人類健康的主要疾病之一，可發(fā)生在任何年齡段，發(fā)病率高，預(yù)后不良。不斷發(fā)掘療效好、毒副作用低的抗癌中草藥是研究的新方向。

筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯可以抑制人SKOV3、A431、HL-60細(xì)胞增殖，并可誘導(dǎo)SKOV3、A431細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)凋亡可能與線粒體膜電位（MMP）下降有關(guān)[1-2]。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，采用Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測穿心蓮內(nèi)酯是否能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合熒光染色檢測穿心蓮內(nèi)酯對HL-60細(xì)胞細(xì)胞色素C（CytC）蛋白表達(dá)的影響。

Annexin/PI雙染法FCM檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯能促進(jìn)HL-60細(xì)胞凋亡，且呈現(xiàn)良好的劑量依賴性； 625、125μg/ml與溶媒對照組相比，早期凋亡率、晚期凋亡率及壞死率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。

細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制十分復(fù)雜，其中最常見的就是線粒體通路。由該通路啟動的細(xì)胞凋亡過程受許多蛋白質(zhì)的調(diào)控，以CytC最常見。

CytC是位于正常細(xì)胞的線粒體內(nèi)、外膜之間。在細(xì)胞凋亡信號刺激下，CytC可從細(xì)胞的線粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞的胞漿，這是線粒體凋亡通路的關(guān)鍵步驟。在各種刺激因素作用下，線粒體外膜通透性增加、線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔（MPTP）持續(xù)性開放、MPP逐漸降低，線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔開放后，線粒體基質(zhì)會腫脹，線粒體外膜更易破裂，釋放出細(xì)胞色素C等膜間蛋白，最終引起細(xì)胞凋亡[3]。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯作用HL-60細(xì)胞24h后，CytC蛋白表達(dá)增加，且高濃度（125μg/ml）與溶媒對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。這一現(xiàn)象表明：穿心蓮內(nèi)酯作用下，可能使HL-60細(xì)胞線粒體膜通透性增高，從而使膜間隙蛋白CytC釋放增加[4]。

總之，本研究結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的凋亡。我們對其機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)，在此過程中CytC蛋白釋放增加，進(jìn)而提示穿心蓮內(nèi)酯可能通過線粒體凋亡途徑促進(jìn)HL-60細(xì)胞凋亡。

參考文獻(xiàn)

[1]石靜，梁勇剛，白慧健，等.穿心蓮內(nèi)酯對SKOV3細(xì)胞凋亡及HER2蛋白表達(dá)的影響[J].解剖學(xué)雜志，2012，35（1）：20-22.

[2]石靜，梁勇剛.穿心蓮內(nèi)酯對人皮膚基底細(xì)胞癌A431細(xì)胞生長、凋亡及增殖細(xì)胞核抗原蛋白表達(dá)的影響[J].解剖學(xué)報(bào)，2013，44（1）：73-78.

[3]石靜，卿晨.線粒體膜電位改變與細(xì)胞凋亡[J].中國民族民間醫(yī)藥，2011，20（7）：20-21.

[4]蔣時(shí)紅，吳耀松，劉燕，等.胃康舒寧促胃癌細(xì)胞凋亡機(jī)制與線粒體凋亡途徑[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，21：203-206.

（收稿日期：20141217）