劉純成 劉林飛 李桂珍 張遠(yuǎn)濤 時(shí)玉軍 楊鵬飛 劉靚

[摘要] 目的 評(píng)價(jià)結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）對(duì)潛伏性結(jié)核診斷及結(jié)核患者治療效果評(píng)價(jià)的應(yīng)用價(jià)值。方法 選擇2012年12月～2014年8月44例治療后肺結(jié)核患者、50例治療后的肺外結(jié)核患者、45例潛伏結(jié)核患者（3個(gè)月服藥后）、92例肺結(jié)核病家庭密切接觸者、肺外結(jié)核患者家庭密切接觸者45例、結(jié)核病防治工作者31例、88例非結(jié)核患者家庭密切接觸者，進(jìn)行外周血T-SPOT.TB檢測(cè)。 結(jié)果 治療后肺結(jié)核患者、治療后肺外結(jié)核患者和潛伏結(jié)核患者（3個(gè)月服藥后）陽(yáng)性率分別為52.27%、52.00%和55.56%，正常人群陽(yáng)性率為6.82%，三種類型患者陽(yáng)性率與正常人群陽(yáng)性率相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；肺結(jié)核患者家庭密切接觸者、肺外結(jié)核患者家庭密切接觸者和結(jié)核病防治醫(yī)務(wù)工作者的陽(yáng)性率分別為30.43%、11.11%和19.35%，肺結(jié)核患者家庭密切接觸者陽(yáng)性率與正常人群陽(yáng)性率相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而肺外結(jié)核患者家庭密切接觸者和結(jié)核病防治醫(yī)務(wù)工作者與正常人群相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn) T-SPOT.TB 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)核敏感性強(qiáng)、特異性高，是快速診斷潛伏性結(jié)核感染的有效方法，是對(duì)結(jié)核患者的治療效果作出評(píng)價(jià)的有效手段，為結(jié)核病的防控提供了一個(gè)非常好的監(jiān)測(cè)手段。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)核病；潛伏性結(jié)核；結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)；陽(yáng)性率

[中圖分類號(hào)] R521 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）28-0122-04

Tracking treatment of tuberculosis patients and investigation of latent tuberculosis

LIU Chuncheng1 LIU Linfei1 LI Guizhen2 ZHANG Yuantao1 SHI Yujun1 YANG Pengfei1 LIU Liang1

1.Department of Laboratory， Huai'an City Center for Disease Control and Prevention in Jiangsu Province， Huai'an 223001， China； 2.Laboratory of Molecular Biology， the Fourth People's Hospital in Huai'an City in Jiangsu Province， Huai'an 223001， China

[Abstract] Objective To investigate the value of T cells spot test （T-SPOT.TB） in tracking treatment of tuberculosis patients and investigation of latent tuberculosis. Methods From December 2012 to August 2014， peripheral blood T-SPOT.TB were measured in the 44 patients with active tuberculosis， 50 patients with extra-pulmonary tuberculosis， 45 patients with latent tuberculosis， 92 patients with close contactors of active tuberculosis， 45 patients with close contactors of extra-pulmonary tuberculosis， 31 medical workers of tuberculosis control and 88 healthy individuals. Results The positive rate of T-SPOT.TB for the diagnosis of active tuberculosis， extra-pulmonary tuberculosis， latent tuberculosis were 52.27%， 52.00%， 55.56%， and healthy individuals was 6.82%， The positive rate of those three kinds of patients was statistically significant with the positive rate of healthy individuals （P<0.01）. The positive rate of close contactors of active tuberculosis， close contactors of extra-pulmonary tuberculosis， medical workers of tuberculosis control were 30.43%， 11.11% and 19.35%. The positive rate of close contactors of active tuberculosis was statistically significant with the positive rate of healthy individuals （P<0.01）， while the positive rate of close contactors of extra-pulmonary tuberculosis and medical workers of tuberculosis control was no statistically significant with the positive rate of healthy individuals（P>0.05）. Conclusion T-SPOT.TB assay can be an effective method for repaid diagnosis of latent tuberculosis infection and the treatment of tuberculosis patients with high specificity and sensitivity， and also is a very useful method for the prevention and control of tuberculosis.

[Key words] Tuberculosis； Latent tuberculosis； T cell spot test； Positive rate

結(jié)核病是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計(jì)，全球約有1/3人口受到結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）感染。2010年，全球約有880萬(wàn)新發(fā)結(jié)核病例，145萬(wàn)人死于結(jié)核病[1]。2013年全球有900萬(wàn)人罹患結(jié)核病，其中近50萬(wàn)人感染的是很難治療的耐多藥結(jié)核?。?012～2013年淮安市共發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性肺結(jié)核患者4907例，新發(fā)涂陽(yáng)1319例，隨著耐多藥結(jié)核病數(shù)量的不斷上升及人類免疫缺陷病毒并發(fā)感染，結(jié)核病的防治工作變得更為嚴(yán)峻[2]。當(dāng)前結(jié)核的診斷存在耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低等問題，探索快速、簡(jiǎn)便的診斷方法一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者們研究的焦點(diǎn)。

根據(jù)結(jié)核感染的狀態(tài)，人群可以分為無結(jié)核感染、活動(dòng)性結(jié)核、潛伏性結(jié)核和治愈。潛伏性結(jié)核（latent tuberculosis infection，LTBI）是宿主感染結(jié)核分枝桿菌后尚未發(fā)病的一種特殊狀態(tài)，潛伏性結(jié)核不僅威脅個(gè)人健康，亦有可能成為潛在的傳染源，對(duì)家庭和社會(huì)造成危害。結(jié)核病患者經(jīng)過治療后往往缺乏有效的愈后監(jiān)測(cè)，給結(jié)核病的防控增加了許多困難。T-SPOT.TB的原理是利用結(jié)核特異抗原（ESAT.6.CFP-10），通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）檢測(cè)受試者體內(nèi)是否存在結(jié)核效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，從而判斷受試者是否感染結(jié)核桿菌（現(xiàn)癥感染） 的新方法。該試驗(yàn)僅需24 h即可得到檢測(cè)結(jié)果，具有操作簡(jiǎn)單、周期短、靈敏度和特異性高等優(yōu)點(diǎn)[3-6]。結(jié)核感染T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB，Oxford Immunotec）作為結(jié)核潛伏感染的診斷手段已經(jīng)在多項(xiàng)研究中證實(shí)具有很高的靈敏度和特異性[7-10]。為了解淮安市登記在冊(cè)的經(jīng)治療的肺外結(jié)核及確診并經(jīng)治療的肺結(jié)核患者以及結(jié)核患者家庭密切接觸人群和結(jié)核病防治工作者結(jié)核病潛在感染情況，本研究對(duì)上述人群進(jìn)行抽樣采集血液進(jìn)行T-SPOT.TB，以了解該群體的結(jié)核感染狀態(tài)，利于結(jié)核病控制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2012年12月～2014年8月淮安市洪澤縣黃集鎮(zhèn)、朱壩鎮(zhèn)登記在冊(cè)的肺結(jié)核病患者及其密切接觸的家庭成員，其中治療后肺結(jié)核患者44例，肺外結(jié)核患者50例，年齡30～79歲，男45例，女49例；潛伏結(jié)核患者（服藥3個(gè)月后）45例、肺結(jié)核患者家庭密切接觸者92例、肺外結(jié)核患者家庭密切接觸者45例，其中男87例，女95例，3～15歲8例，16～30歲13例，30歲以上161例，年齡最小3歲，年齡最大77歲；31例結(jié)核病防治工作者，另選擇非結(jié)核患者家庭密切接觸者（正常人群）88例為對(duì)照，分別采集靜脈血5 mL，進(jìn)行T-SPOT.TB檢測(cè)。

1.2 材料

RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)液AIM-V培養(yǎng)基，F(xiàn)icoll-Hyperque淋巴細(xì)胞分離液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），T-SPOT.TB試劑盒。

1.3 T-SPOT.TB試驗(yàn)方法

采集肝素抗凝血5 mL，分離PBMC進(jìn)行計(jì)數(shù)，保證加入反應(yīng)孔中的細(xì)胞數(shù)達(dá)到2.5×105個(gè)/100 μL；每個(gè)檢測(cè)需4個(gè)反應(yīng)孔，分別為陰性、ESAT-6、CFP-10、陽(yáng)性孔；加好細(xì)胞和刺激源后放入5%CO2，37℃培養(yǎng)18～24 h；洗滌后加入生物素標(biāo)記的二抗，反應(yīng)1 h；洗滌后加入顯色劑，避光顯色7 min后，在細(xì)胞因子分泌的地方形成斑點(diǎn)，通過計(jì)數(shù)斑點(diǎn)檢測(cè)受結(jié)核特異性抗原刺激后釋放γ干擾素的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞數(shù)量。陰性孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)<6時(shí)，ESAT-6或CFP-10孔中斑點(diǎn)數(shù)-陰性孔≥6結(jié)果為陽(yáng)性；若陰性孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)≥6時(shí)，ESAT-6或CFP-10孔中斑點(diǎn)數(shù)>陰性孔的2倍結(jié)果亦為陽(yáng)性。

1.4 再次T-SPOT.TB檢測(cè)

對(duì)T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的密切接觸者（潛伏性結(jié)核）進(jìn)行預(yù)防性服藥治療，治療后再次進(jìn)行T-SPOT.TB檢測(cè)。

1.5 觀察指標(biāo)

觀察結(jié)核患者治療前后T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性率和陰性率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，率（%）的比較均采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核患者治療后 T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果比較

根據(jù)T-SPOT.TB試劑盒說明書，檢測(cè)結(jié)果見圖1。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，治療后肺結(jié)核患者、治療后肺外結(jié)核患者和潛伏結(jié)核患者（3個(gè)月服藥后）陽(yáng)性率分別為52.27%、52.00%和55.56%，而正常人群陽(yáng)性率為6.82%，χ2檢驗(yàn)表明，治療后肺結(jié)核患者、治療后肺外結(jié)核患者和潛伏結(jié)核患者陽(yáng)性率與對(duì)照者比較差異均具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1、圖1。

表1 結(jié)核患者經(jīng)治療后T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果比較

2.2 結(jié)核患者密切接觸者T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果比較

T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果表明，肺結(jié)核患者家庭密切接觸者、肺外結(jié)核患者家庭密切接觸者和結(jié)核病防治醫(yī)務(wù)工作者的陽(yáng)性率分別為30.43%、11.11%和19.35%，χ2檢驗(yàn)表明，肺結(jié)核患者家庭密切接觸者陽(yáng)性率與正常人群陽(yáng)性率（6.82%）相比差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而肺外結(jié)核患者家庭密切接觸者和結(jié)核病防治醫(yī)務(wù)工作者與正常人群比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 結(jié)核密切接觸者的T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果比較

3討論

肺結(jié)核患者經(jīng)治療后常采用查痰及影像學(xué)判斷患者是否有治療效果，肺外結(jié)核患者經(jīng)治療后一般通過影像學(xué)和病理學(xué)檢查判斷患者是否有治療效果，而沒有檢查患者體內(nèi)是否還有結(jié)核菌在繼續(xù)感染增殖。肺外結(jié)核病變部位不一致，典型的臨床癥狀不明顯，容易被忽視，以致臨床上常被誤診或漏診，需要通過臨床癥狀和輔助檢查，特別是病理檢查綜合分析診斷結(jié)核感染。Kim等[11]報(bào)道，在肺外結(jié)核患者中，T-SPOT.TB的陽(yáng)性率為94%。還有試驗(yàn)表明，IGRA準(zhǔn)確性對(duì)于活動(dòng)性肺內(nèi)、肺外結(jié)核的診斷沒有明顯差異[12]。T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）作為結(jié)核潛伏感染的診斷手段已經(jīng)在多項(xiàng)研究中證實(shí)具有很高的靈敏度和特異性。在結(jié)核桿菌特異性抗原刺激下，測(cè)定外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中能夠釋放IFN2γ的T細(xì)胞數(shù)量，從而判斷出體內(nèi)是否還有結(jié)核菌感染。本次實(shí)驗(yàn)我們采用T-SPOT.TB技術(shù)檢測(cè)經(jīng)治療的肺內(nèi)、肺外結(jié)核患者的血液判斷患者經(jīng)藥物治療的效果，經(jīng)檢測(cè)44例肺結(jié)核患者，T-SPOT.TB陽(yáng)性23例，陰性21例，陽(yáng)性率為52.27%；50例肺外結(jié)核患者，26例陽(yáng)性，24例陰性，陽(yáng)性率為52.00%，與正常人群比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=35.35、36.54，P<0.01），表明T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性者還需進(jìn)一步服藥治療。

結(jié)核患者的家庭成員及結(jié)核病防治工作人員屬于密切接觸人群，為高風(fēng)險(xiǎn)人群。92例肺結(jié)核患者家庭密切接觸者陽(yáng)性28例，陽(yáng)性率為30.43%，肺外結(jié)核患者家庭密切接觸者45例，陽(yáng)性率為11.11%，結(jié)核病防治工作者31例，陽(yáng)性率為19.35%，正常人群陽(yáng)性率為6.82%，肺結(jié)核患者家庭密切接觸者陽(yáng)性率與正常人群陽(yáng)性率相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=16.37，P<0.01），而肺外結(jié)核患者家庭密切接觸者和結(jié)核病防治醫(yī)務(wù)工作者與正常人群相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.72、3.54，P>0.05）；主要由于肺結(jié)核的傳染以呼吸道傳播為主，傳播速度快，范圍廣，肺外結(jié)核因感染的部位不同，以排泄物的接觸傳播為主，多數(shù)的肺外結(jié)核（如淋巴結(jié)核、骨結(jié)核等）因不能將病原菌排出體外，對(duì)密切接觸者幾乎沒有傳染性。通過檢測(cè)說明結(jié)核患者的家庭中，更應(yīng)注意結(jié)核病的防范，加強(qiáng)防御措施。對(duì)于已經(jīng)感染的群體，應(yīng)注意身體狀況。已有研究表明，很多因素會(huì)導(dǎo)致潛伏結(jié)核發(fā)展為活動(dòng)結(jié)核，包括飲酒、體重過輕、抽煙等不良習(xí)慣。接觸者與患者的接觸時(shí)間增加， 結(jié)核潛隱感染的危險(xiǎn)性增加， 可能與結(jié)核感染與接觸結(jié)核患者產(chǎn)生的時(shí)間累積效應(yīng)有關(guān)[13]。醫(yī)務(wù)人員還需不斷加強(qiáng)自身的防范意識(shí)。

T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的密切接觸者（潛伏性結(jié)核）45例，空腹采血做轉(zhuǎn)氨酶及X光檢測(cè)，X光檢測(cè)結(jié)果有1例已有輕度結(jié)核性胸膜炎表現(xiàn)，轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)皆正常，對(duì)T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的密切接觸者（潛伏性結(jié)核）進(jìn)行預(yù)防性服藥治療，采取知情自愿的原則，預(yù)防性服藥方案：體重≥50 kg，異福片（內(nèi)含 0.15 g異煙肼 和0.3 g利福平），1次/1 d，1次2片，服藥3個(gè)月。體重<50 kg者，異煙肼0.3 g，1次/d，利福平0.3 g，1次/d。預(yù)防性服藥90 d，并進(jìn)行跟蹤觀察。90 d后，采靜脈血T-SPOT.TB檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表1。其中25例T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果仍為陽(yáng)性，20例陰性，陽(yáng)性率為55.56%，說明此類患者體內(nèi)依然存在結(jié)核致敏的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞。鑒于目前大量研究表明T-SPOT.TB在結(jié)核患者中靈敏度為95%左右[14-19]，而此次檢測(cè)中T-SPOT.TB結(jié)果有45%的患者為陰性，說明此類患者體內(nèi)已經(jīng)沒有了結(jié)核致敏的T細(xì)胞，治療效果明顯。

T-SPOT.TB檢測(cè)是利用外周血進(jìn)行檢測(cè)，相比傳統(tǒng)TST等檢測(cè)手段，簡(jiǎn)便易行，且準(zhǔn)確度更高。檢測(cè)物不僅局限于靜脈血、支氣管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、腦脊液等，也可用于對(duì)肺內(nèi)及肺外結(jié)核的診斷。T-SPOT.TB在結(jié)核病的診斷中具有良好的前景和應(yīng)用價(jià)值，尤其是在潛伏性結(jié)核感染及菌陰肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷與鑒別診斷中。隨著方法的改進(jìn)以及新抗原的應(yīng)用，T-SPOT.TB很可能會(huì)成為新一代的結(jié)核病診斷方法。本文對(duì)已治療肺結(jié)核患者、已治療肺外結(jié)核患者和潛伏結(jié)核患者（已治療）采用T-SPOT.TB檢測(cè)受試者體內(nèi)是否存在結(jié)核效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，從而判斷受試者是否還存在結(jié)核桿菌感染，對(duì)結(jié)核患者的治療效果作出評(píng)價(jià)，為結(jié)核病的防控提供一個(gè)非常好的監(jiān)測(cè)手段，值得在今后的工作中進(jìn)一步加以推廣。

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（收稿日期：2015-07-08）