劉敏杰 方來福 胡萍萍 翁科娜 邊佳 毛佳瑜

[摘要] 目的 探討DyrklB在宮頸癌組織中的表達及其臨床意義。 方法 利用免疫組化檢測DyrklB在60例宮頸癌組織、60例宮頸癌癌旁組織和60例正常宮頸組織中的表達，分析DyrklB在宮頸癌組織中的表達狀況以及與宮頸癌臨床參數(shù)的關系。 結果 Dyrk1B 在宮頸癌組織中的表達（60/60，100%）明顯高于癌旁組織（26/40，65%）和正常宮頸組織（16/40，40%），三組間比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=88.21，P<0.01）。Dyrk1B的強陽性率與宮頸癌的組織學分化程度有明顯相關性（P<0.05），與宮頸癌患者的年齡、臨床分期和有無淋巴轉移等無明顯相關性（P>0.05）。 結論 DyrklB在宮頸癌中高表達，提示其可能參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并有望成為宮頸癌早期診斷的標志物和治療的靶基因。

[關鍵詞] Mirk/Dyrk1B；宮頸癌；免疫組化

[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）28-0001-03

Expression and clinical significance of Dyrk1B in cervical carcinoma

LIU Minjie1 FANG Laifu2 HU Pingping1 WENG Kena1 BIAN Jia1 MAO Jiayu1

1.Department of Obstetrics and Gynecology，Yinzhou People`s Hospital of Ningbo City，Ningbo 315040，China；2.Department of Pathology，Yinzhou People`s Hospital of Ningbo City，Ningbo 315040，China

[Abstract] Objective To investigate the expression of DyrklB in cervical cancer and its clinical significance. Methods Immunohistochemical methods were used to detect the expression levels of DryklB in 60 cases cervical carcinoma tissues，60 cases of cervical cancer adjacent tissues and 60 cases normal cervical tissues. DryklB expression in cervical carcinoma and relationship with clinical parameters of cervical carcinoma. Results The expression of Dyrk1B in cervical cancer tissues was significantly higher than that in cervical cancer adjacent tissues and normal cervical tissues，and there was statistical significance between the three groups（χ2=88.21，P<0.01）. There was a significant correlation between the strong positive rate of Dyrklb and degree of histological differentiation（P<0.05），but there was no correlation between the strong positive rate of Dyrklb and patients age，clinical stage and lymph node metastasis of cervical carcinoma（P>0.05）. Conclusion The expression level of Dyrk1b in cervical carcinoma tissues is high，which indicates that it may participate in the occurrence and development of cervical carcinoma ，and it may become a tumor marker for clinical early diagnosis and a new target gene for treatment of cervical carcinoma.

[Key words] Mirk/Dyrk1B；Cervical carcinoma；Immunohistoehemical

雙重特異性酪氨酸磷酸化調節(jié)激酶1B（dual-specificity tyrosine-phosphorylation regulated kinase 1B，Dyrk1B；又稱Mirk）屬Minibrain Dyrk家族成員，是一種蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶，該蛋白基因定位在人類19號染色體q12-13.11上，其功能是特異性磷酸化下游的雙鏈酪氨酸[1]，是一種特異性的雙鏈酪氨酸磷酸化激酶[2]，最初是從結腸癌細胞株[3]和人類睪丸組織[4]中分離出來的。DyrklB可在翻譯過程中完成自身磷酸化，并同時有磷酸化其他絲氨酸、蘇氨酸的能力[5]，研究證實，Dyrk1B在細胞轉錄、細胞周期及細胞凋亡的調節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。通過血清饑餓誘導靜止狀態(tài)，同時通過siRNA等方法沉默Dyrk1B的表達，可減少多種腫瘤細胞系的集落形成，并增強化療藥物誘導的細胞凋亡。Dyrk1B 除在人類的腦組織及肌肉組織中有表達外，在大多數(shù)正常組織中呈低表達或不表達[6]，但在某些惡性腫瘤組織中呈高水平表達，如胰腺癌[7，8]、結腸癌[9]、肺癌[10，11]、卵巢癌[12-14]、橫紋肌肉瘤[15]、前列腺癌[16]等。Dyrk1B在宮頸癌細胞中的表達水平未見報道，本研究旨在應用免疫組化方法檢測宮頸癌組織、癌旁組織及正常宮頸組織中Dyrk1B的表達情況，探討Dyrk1B與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展、分化程度、侵襲的相關性及其臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

收集本院2013年1月～2014年8月宮頸癌手術切除標本60例，年齡25～67歲，平均（51.0±9.2）歲，中位年齡50歲。每例分別取一塊癌組織、癌旁組織和正常宮頸組織進行免疫組化染色。宮頸浸潤癌60例。宮頸癌按組織學分級分為：高分化24例，中分化20例， 低分化16 例； 按2000年FIGO臨床分期分為Ⅰ期31例，Ⅱ期25例，Ⅲ期4例；有淋巴結轉移22例，無淋巴結轉移38例。所有患者術前及活檢前均未接受化療或放療。所有標本的診斷數(shù)據(jù)均經(jīng)病理證實， 并附有完整的臨床病理資料。患者術前均未接受化療或放療。

1.2 試劑與方法

應用免疫組化S-P方法檢測Dyrk1B蛋白的表達。Dyrk1B抗體購自英國abcam公司，SP試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司。Dyrk1B檢測實驗步驟：①石蠟切片3～4 μm，65℃烤片過夜；②組織切片脫蠟、水化；③滅活內源性過氧化物酶（3%H2O2，10 min）；④用PBS沖洗3次，每次2 min；⑤抗原熱修復（EDTA pH=9.0，20 min）；⑥蒸餾水沖洗，PBS沖洗3次，每次2 min；⑦正常封閉血清（羊血清工作液，室溫下10 min）；⑧傾去血清加一抗室溫1 h（稀釋比Dyrk1B 1∶400）；⑨蒸餾水沖洗，PBS沖洗3次，每次2 min；⑩二抗，即用型廣譜試劑盒，室溫25 min；{11}蒸餾水沖洗，PBS沖洗3次，每次2 min；{12}DAB顯色3～10 min（即用型DAB顯色液，鏡下控制）；{13}蘇木素復染、藍化；{14}切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片.具體操作過程嚴格按照說明進行。用已知睪丸和骨骼肌作陽性對照，應用PBS代替一抗作陰性對照，在每個蠟塊標本的連續(xù)切片中選一張做HE染色，用于免疫組化陽性染色部位的對照判定和分析。

1.3 判定標準

Dyrk1B蛋白主要定位于胞質和胞核。隨機選擇10個高倍（×400）視野，根據(jù)陽性細胞百分率及顯色深淺采用半定量積分法分級。評分標準如下[14]：（1）陽性細胞百分率：（a）無著色，0分；（b）<25%，1分；（c）25%～75%，2分；（d）>75%，3分。（2）顯色深淺：（a）不顯色或顯色不清為0分；（b）淺黃色為1分；（c）棕黃色為2分；（d）棕褐色為3分。以上兩項相加最終評定結果，0～1分為陰性（-），2～4分為陽性（+），5～6分為強陽性（++）。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用 SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行處理。校正χ2檢驗組間差異的顯著性，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Dyrk1B在宮頸癌組織不同部位的表達情況

Dyrk1B在宮頸癌癌組織（60/60，100%）、癌旁組織（26/40，65%）的表達水平較正常宮頸組織（16/40， 40%）明顯升高，差異有高度統(tǒng)計學意義（χ2=88.21，P<0.01），見表1。Dyrk1B在正常宮頸組織、癌旁組織及宮頸癌組織中表達情況見圖1、2、3。

表1 Dyrk1B在宮頸癌組織不同部位的表達情況

2.2 Dyrk1B表達與宮頸癌臨床病理特征的關系

表2中可見宮頸癌中Dyrk1B的表達與年齡、有無淋巴結轉移和TNM分期無關（P>0.05），與分化程度存在一定的關系（P<0.05）；Dyrk1B蛋白表達于所有的宮頸癌組織，但是宮頸癌的陽性強度隨宮頸癌組織的病理分化程度的降低而升高，Dyrk1B蛋白在低分化宮頸癌組織的強陽性表達（16/16，100.0%）明顯高于中分化組（13/20，65.0%）和高分化組（13/24， 54.2%），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=9.960，P<0.05）。

表2 Dyrk1B蛋白表達與宮頸癌臨床病理特征的關系

3 討論

宮頸癌在全球女性腫瘤中的發(fā)病率占第3位、死亡率占第4位[17，18]，在發(fā)展中國家其發(fā)病率居第一位。研究報道全球每年新發(fā)宮頸癌例數(shù)約為46.5萬，占婦女新發(fā)癌癥病例15%，其中我國每年新病例有13.15萬，約占總數(shù)的1/3。近年來，年輕婦女的宮頸癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢，流行病學調查發(fā)現(xiàn)其與性生活紊亂、過早性生活、高危型人乳頭瘤病毒（HPV）感染、吸煙、經(jīng)濟狀況低下、種族和地理環(huán)境等因素有關。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個逐步演變、進展的復雜而連續(xù)的過程，與多種癌基因和抑癌基因的表達、調控及細胞凋亡密切相關，其機制目前仍不明確。尋找并發(fā)現(xiàn)宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的相關敏感指標，對阻斷宮頸癌癌前病變的發(fā)展，減少宮頸癌的發(fā)生，對臨床早期診斷、早期治療、判斷轉歸，具有重要的指導意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中Dyrk1B蛋白的強陽性表達與患者年齡、臨床分期以及淋巴結轉移等無相關性（P>0.05），但其強陽性表達和宮頸癌組織病理分化程度有一定的相關性，低分化組（16/16， 100%）明顯高于中分化組（13/20，65%）和高分化組（13/24，54.2%），三組比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=9.960，P<0.05）。Dyrk1B蛋白隨著宮頸癌的病理分化程度降低而升高，提示Dyrk1B蛋白可能參與了宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展，對宮頸癌的診斷和預后都有一定的價值。DyrklB的表達具有細胞依賴性，在正常組織細胞中趨向于細胞核內表達，調節(jié)細胞的存活與分化，而在腫瘤細胞中則多富集在細胞核周的胞漿內，參與腫瘤細胞抗凋亡活性的產(chǎn)生。當腫瘤細胞處于不利生長條件下時，DyrklB可使細胞進入暫時“休眠”狀態(tài)的G0期，躲避應激環(huán)境損傷及化療藥物的“殺傷”，而該過程是可逆性的，當生長環(huán)境改善時G0期細胞又可重返細胞增殖周期，再次開始惡性增殖[19，20]，可見DyrkIB在腫瘤的復發(fā)與化療耐藥過程中可能起到了重要作用。

目前，已經(jīng)有研究者將Dyrklb 作為抗腫瘤治療靶點的研究對象，通過血清饑餓誘導靜止狀態(tài)，同時通過siRNA等方法沉默Dyrk1B的表達，可減少多種腫瘤細胞系的集落形成，并增強化療藥物誘導的細胞凋亡。有研究表明通過siRNA等方法沉默Dyrk1B的表達，不僅可大幅度削弱腫瘤軟瓊脂克隆形成和引起細胞內ROS水平的增加[21]，而且能增強化療藥物誘導的細胞凋亡，抑制胰腺癌在體內的增殖[22]，聯(lián)合化療藥物對腫瘤患者進行治療，最終評估其作為潛在的腫瘤標志物和腫瘤藥物靶點的可能性。由于Dyrk1B與宮頸癌的診斷和預后都存在一定的關系，未來很可能是一個潛在的宮頸癌的腫瘤標志物和新的化療藥物靶點基因，為宮頸癌的診斷和治療提供新的思路。

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（收稿日期：2015-06-05）