黃其俊 宋大偉 吳堅(jiān)敏 汪強(qiáng)

[摘要] 目的 探討外周血結(jié)核T細(xì)胞檢測(cè)在肺結(jié)核涂陰患者診斷中的臨床價(jià)值。 方法 將研究對(duì)象分為兩組：肺結(jié)核組96例，其中涂陰肺結(jié)核71例，其他肺部疾病組60例。所有患者分別進(jìn)行外周血結(jié)核T細(xì)胞的γ-干擾素釋放試驗(yàn)（TB-IGRA）、血清結(jié)核抗體和結(jié)核菌素試驗(yàn)（PPD試驗(yàn)）。 結(jié)果TB-IGRA試驗(yàn)、結(jié)核抗體和PPD試驗(yàn)在涂陰肺結(jié)核組與其他肺部疾病組陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01）；TB-IGRA試驗(yàn)在肺結(jié)核涂陰組與涂陽(yáng)組中定性與定量結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05），其在涂陰肺結(jié)核診斷中敏感性和特異性分別是90.1%和91.7%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別是92.8%和88.7%，與結(jié)核抗體和PPD試驗(yàn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 結(jié)論 外周血結(jié)核T細(xì)胞檢測(cè)在涂陰肺結(jié)核的診斷上具有敏感性和特異性高、結(jié)果客觀等優(yōu)點(diǎn)，有助于對(duì)涂陰肺結(jié)核的患者進(jìn)行鑒別診斷，以避免誤診誤治。

[關(guān)鍵詞] 痰涂片；肺結(jié)核；診斷；外周血結(jié)核感染T細(xì)胞

[中圖分類號(hào)] R521 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）28-0099-04

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人們健康的呼吸道傳染病，我國(guó)結(jié)核病發(fā)病人數(shù)居世界第二位[1]?？焖贉?zhǔn)確地檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的感染是控制結(jié)核病流行的關(guān)鍵[2]。細(xì)菌學(xué)檢查是診斷肺結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，但是肺結(jié)核涂陰患者的診斷在臨床上常由于痰涂片檢測(cè)陰性、痰培養(yǎng)方法檢測(cè)周期長(zhǎng)和敏感性低等問(wèn)題，給臨床診斷帶來(lái)一定的困難。影像學(xué)、結(jié)核菌素試驗(yàn)、結(jié)核抗體和分子診斷技術(shù)均存在一定的局限性[3]，因此尋求新方法對(duì)肺結(jié)核進(jìn)行早期診斷具有重要的臨床意義。結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的主要致病原，屬于胞內(nèi)感染菌，誘發(fā)反應(yīng)是以T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫[4]。近年來(lái)，建立在以T細(xì)胞為基礎(chǔ)的結(jié)核分枝桿菌特異性γ-干擾素釋放試驗(yàn)?zāi)壳耙蚜腥霘W美等國(guó)家結(jié)核病診療指南，以協(xié)助診斷結(jié)核感染的存在[5，6]。本試驗(yàn)主要探討外周血結(jié)核T細(xì)胞檢測(cè)在肺結(jié)核涂陰患者診斷中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2013年7月～2015年3月在我院感染科或呼吸科診治的患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：①患者有咳痰、咳嗽等呼吸道癥狀，CT檢查或X片顯示肺部有陰影；②年齡18～60歲，性別不限。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠；②SLE、風(fēng)濕等自身免疫性疾?。虎郯滩?；④器官移植、使用免疫抑制劑等患者。肺結(jié)核診斷主要依據(jù)痰涂片檢查、影像學(xué)資料和臨床癥狀并參照肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)排除其他疾病后確診[7]。涂陰肺結(jié)核的診斷符合中華結(jié)核病診治指南。其他肺部疾病患者通過(guò)血常規(guī)、痰培養(yǎng)、胸片等檢查確診或抗炎治療排除肺結(jié)核者，如肺炎、肺部腫瘤、支氣管擴(kuò)張等。將入選患者分為兩組：肺結(jié)核組96例（含涂陽(yáng)25例和涂陰71例），其中男59例，女37例，平均年齡（45.2±13.1）歲；其他肺部疾病組60例，包括肺炎34例，肺氣腫9例，肺癌11例，慢性阻塞性肺疾病6例，其中男37例，女23例，平均年齡（46.9±14.5）歲。兩組患者一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

入選患者分別檢查痰涂片（抗酸染色）、外周血結(jié)核T細(xì)胞檢測(cè)、結(jié)核抗體（膠體金法）和PPD試驗(yàn)。

1.2.1 外周血結(jié)核T細(xì)胞檢測(cè) 體外釋放酶聯(lián)免疫法，北京萬(wàn)泰生物公司試劑盒。（1）IFN-γ的體外釋放：①在2 h內(nèi)將全血標(biāo)本輕柔顛倒混勻3～5次后分裝到N（本底對(duì)照）、T（測(cè)試）、P（陽(yáng)性對(duì)照）三種培養(yǎng)管中，1 mL/管。②培養(yǎng)：將培養(yǎng)管輕柔顛倒混勻5次后迅速置入37℃培養(yǎng)（22±2）h，培養(yǎng)過(guò)程中須保持培養(yǎng)管直立。③離心：培養(yǎng)后的培養(yǎng)管以（3000～5000） r/min離心10 min，取血漿進(jìn)行ELISA檢測(cè)，注意不可吸到細(xì)胞層。（2）IFN-γ的定量檢測(cè)：采用ELISA法，以校準(zhǔn)品（12.5 pg/mL、25 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL、400 pg/mL）的抗原含量及其對(duì)應(yīng)的吸光度均值制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出線性回歸方程，將N、T、P三種培養(yǎng)管培養(yǎng)后血漿標(biāo)本的吸光度值分別代入回歸方程，求得三種管中血漿標(biāo)本相應(yīng)的IFN-γ含量。（3）IFN-γ的陽(yáng)性判定：按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以T管與N管含量差值即（T-N）≥14，并且≥N/4，結(jié)果判定為陽(yáng)性[8]。

1.2.2 結(jié)核菌素試驗(yàn) 采用成都生物制品研究所生產(chǎn)的試劑（BCG-PPD，50 IU/mL）。①以PPD試劑0.1 mL（5IU）于左前臂內(nèi)側(cè)中上1/3處皮內(nèi)注射，使局部形成皮丘。②經(jīng)72 h后觀察注射部位硬結(jié)平均直徑[（橫徑+縱徑）/2）]。硬結(jié)<5 mm為陰性，5～9 mm為弱陽(yáng)性，10～19 mm為陽(yáng)性反應(yīng)，提示結(jié)核桿菌感染，≥20 mm（或<20 mm但有水皰或壞死時(shí)）為強(qiáng)陽(yáng)性[9]。本研究以硬結(jié)直徑≥10 mm時(shí)，結(jié)果判定為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TB-IGRA試驗(yàn)、結(jié)核抗體和PPD試驗(yàn)對(duì)涂陰肺結(jié)核診斷的評(píng)價(jià)指標(biāo)分析

由公式：靈敏度=真陽(yáng)性/（真陽(yáng)性+假陰性）可知，在涂陰肺結(jié)核組中TB-IGRA試驗(yàn)敏感性為90.1%[64/（64+7）]，與血清結(jié)核抗體和PPD試驗(yàn)的敏感性相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=16.7、8.7，P<0.01）。TB-IGRA試驗(yàn)在涂陰肺結(jié)核組的敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在其他肺部疾病組中的敏感性（χ2=87.3，P<0.01）。由公式：特異性=真陰性/（真陰性+假陽(yáng)性）可知：TB-IGRA試驗(yàn)在涂陰肺結(jié)核診斷中的特異性為91.7%[55/（55+5）]，明顯高于結(jié)核抗體（73.3%）和PPD試驗(yàn)（68.3%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.0、10.2，P<0.01）。見(jiàn)表1。TB-IGRA試驗(yàn)對(duì)涂陰肺結(jié)核診斷的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為92.8%，與血清結(jié)核抗體、PPD試驗(yàn)相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.9、9.2，P<0.01）。TB-IGRA試驗(yàn)對(duì)涂陰肺結(jié)核診斷的陰性預(yù)測(cè)值為88.7%，與血清結(jié)核抗體和PPD試驗(yàn)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.1、9.0，P<0.01）。

表1 TB-IGRA試驗(yàn)、結(jié)核抗體和PPD試驗(yàn)對(duì)涂陰肺結(jié)核診斷的評(píng)價(jià)指標(biāo)比較

2.2 肺結(jié)核患者涂陰、涂陽(yáng)組TB-IGRA試驗(yàn)定性與定量結(jié)果比較

TB-IGRA試驗(yàn)在肺結(jié)核涂陰、涂陽(yáng)兩組中的敏感性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.075，P>0.05），兩組中的定量結(jié)果比較也無(wú)顯著性差異（t=0.59，P>0.05），見(jiàn)表2。

表2 肺結(jié)核患者涂陰、涂陽(yáng)組TB-IGRA試驗(yàn)定性與定量結(jié)果比較

3 討論

肺結(jié)核是一種常見(jiàn)且難以進(jìn)行病原學(xué)診斷的疾病，防治形勢(shì)不容樂(lè)觀[10]。對(duì)于肺結(jié)核患者進(jìn)行早期診斷和治療是控制結(jié)核病播散的重要環(huán)節(jié)，也是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。痰涂片抗酸染色比培養(yǎng)快，能在早期為呼吸道感染的診斷和治療提供重要信息，但無(wú)法區(qū)分死活菌及非結(jié)核分枝桿菌，受制于痰液中分枝桿菌的數(shù)量，故敏感性較低[11]，本研究陽(yáng)性率僅為26.0%（25/96），使漏檢人數(shù)顯著增加。肺結(jié)核常表現(xiàn)為午后低熱、納差、乏力、盜汗、消瘦等，呼吸道方面有咯血、咳痰、咳嗽、呼吸困難和不同程度胸悶、胸痛等癥狀。目前，診斷痰菌涂陰的肺結(jié)核患者主要依靠典型的臨床癥狀、PPD試驗(yàn)或經(jīng)纖維支氣管鏡的肺組織活檢、肺部影像檢查的特征性改變等，但臨床上仍有部分患者缺乏典型的臨床癥狀和肺部影像學(xué)改變、PPD試驗(yàn)呈陰性或弱陽(yáng)性、不愿接受纖支鏡檢查或病情重不能耐受者，因此給涂陰肺結(jié)核的診斷帶來(lái)困擾。

我國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展的結(jié)核病相關(guān)檢查有皮膚結(jié)核菌素試驗(yàn)、血清結(jié)核抗體、痰涂片找抗酸桿菌和結(jié)核桿菌培養(yǎng)等，這些方法在診斷敏感性和特異性等方面均存在一些不足。結(jié)核菌素試驗(yàn)是基于Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)的一種皮膚試驗(yàn)，用來(lái)檢測(cè)機(jī)體有無(wú)感染過(guò)結(jié)核桿菌，凡感染過(guò)結(jié)核桿菌的機(jī)體，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的致敏淋巴細(xì)胞，具有對(duì)結(jié)核桿菌的識(shí)別能力，當(dāng)再次遇到少量的結(jié)核桿菌或結(jié)核菌素時(shí)，致敏T淋巴細(xì)胞受相同抗原再次刺激會(huì)釋放出多種可溶性淋巴因子，導(dǎo)致血管通透性增加，巨噬細(xì)胞在局部集聚，導(dǎo)致浸潤(rùn)，約在48～72 h內(nèi)，局部出現(xiàn)紅腫硬結(jié)的陽(yáng)性反應(yīng)，若受試者未感染過(guò)結(jié)核桿菌，則注射局部無(wú)變態(tài)反應(yīng)發(fā)生[12]，但該試驗(yàn)容易受到交叉反應(yīng)、機(jī)體免疫力狀況等影響[13]，PPD試驗(yàn)陰性還可見(jiàn)于以下情況：結(jié)核菌感染后需4～8周有變態(tài)反應(yīng)充分建立，在變態(tài)反應(yīng)前期，PPD試驗(yàn)常陰性；嚴(yán)重結(jié)核病和各種危重患者對(duì)結(jié)核菌素?zé)o反應(yīng)或弱陽(yáng)性，是由于人體免疫力連同變態(tài)反應(yīng)暫時(shí)受到抑制的結(jié)果；其他如淋巴細(xì)胞免疫系統(tǒng)缺陷（如白血病、淋巴瘤、艾滋病等）患者和老年人的結(jié)核菌素反應(yīng)也常為陰性。硬結(jié)直徑為5～9 mm不能排除因接種卡介苗所致，本研究即使以硬結(jié)直徑10 mm作為診斷臨界值，特異性僅為68.3%。血清結(jié)核抗體檢測(cè)也會(huì)因接種卡介苗或其他分枝桿菌感染等影響而出現(xiàn)假陽(yáng)性，而在免疫力低下患者，不能產(chǎn)生足量的結(jié)核抗體導(dǎo)致假陰性結(jié)果[14]。外周血結(jié)核T細(xì)胞的γ-干擾素釋放試驗(yàn)是結(jié)核病診斷領(lǐng)域的重要進(jìn)展，建立在以T細(xì)胞為基礎(chǔ)的體外IFN-γ測(cè)定方法，從而評(píng)估患者的T淋巴細(xì)胞是否被結(jié)核分枝桿菌特異性抗原致敏。本試驗(yàn)試劑盒采用體外釋放酶聯(lián)免疫法原理衡量特異性抗原介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)強(qiáng)度。主要使用兩種特異性抗原，分別是ESAT-6（早期分泌抗原-6）和CFP-10（培養(yǎng)濾出液蛋白-10），刺激結(jié)核分枝桿菌感染者特異性T淋巴細(xì)胞并使其增殖，釋放γ-干擾素。微孔條上預(yù)包被的IFN-γ抗體可與標(biāo)本中的IFN-γ結(jié)合，再加入酶標(biāo)試劑進(jìn)行二次混育。當(dāng)標(biāo)本中存在IFN-γ時(shí)，將形成“包被抗體-IFN-γ-酶標(biāo)抗體”復(fù)合物，然后進(jìn)行ELISA顯色，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，計(jì)算標(biāo)本中的IFN-γ含量，從而判斷該患者是否具有針對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，可用于結(jié)核分枝桿菌潛伏感染或活動(dòng)感染的輔助診斷。本試劑盒采用的致病性結(jié)核分枝桿菌有卡介苗、其他分枝桿菌沒(méi)有的缺失區(qū)域1（RD1）中兩種基因的重組抗原[15，16]，因此其結(jié)果不受卡介苗接種和非結(jié)核分枝桿菌的影響，國(guó)內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果顯示該試驗(yàn)對(duì)結(jié)核感染有較高的診斷價(jià)值[17-20]。由表1可知，TB-IGRA試驗(yàn)對(duì)于涂陰肺結(jié)核診斷的敏感性（90.1%）、特異性（91.7%）均較高，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為92.8%，陰性預(yù)測(cè)值為88.7%，與其他肺部疾病組相比存在顯著性差異，與同組的PPD試驗(yàn)、血清結(jié)核抗體相比也存在顯著性差異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)TB-IGRA試驗(yàn)在肺結(jié)核涂陽(yáng)、涂陰兩組中靈敏度無(wú)顯著性差異，因此在指導(dǎo)涂陰結(jié)核的診斷方面具有重要的臨床意義。

綜上所述，肺結(jié)核痰涂片菌陰性患者臨床診斷有時(shí)較為困難，皮膚PPD試驗(yàn)和血清結(jié)核抗體因其較高的假陽(yáng)性、假陰性，常可能造成臨床的誤診和漏診。外周血結(jié)核T細(xì)胞檢測(cè)作為一種新的早期診斷結(jié)核感染的免疫學(xué)方法，對(duì)涂陰患者顯示出非常高的敏感性和特異性，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作簡(jiǎn)便，不需要特別儀器，IFN-γ含量結(jié)果客觀，也不受確診前的預(yù)防性和經(jīng)驗(yàn)性等抗結(jié)核治療的影響，對(duì)臨床癥狀不典型、PPD試驗(yàn)診斷不明確、涂陰肺結(jié)核具有重要的臨床價(jià)值。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 全國(guó)第五以結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組，全國(guó)第五以結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室. 2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告[R]. 中國(guó)防癆雜志，2012，34（8）：485-508.

[2] 唐神結(jié)，肖和平. 結(jié)核病流行趨勢(shì)及治療未來(lái)展望[J]. 中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志，2012，32（8）：565.

[3] 袁麗娜，黨霞，史慧敏，等. 不同檢測(cè)方法對(duì)結(jié)核病的診斷價(jià)值[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011，46（6）：945.

[4] Tsujimura K，Koide Y. T cell-mediated immune responses and the recognition of tuberculosis antigens[J]. Kekkaku，2010，85（6）：509.

[5] Denkinger CM，Dheda K，Pai M. Guidelines on interferon-γ release assays for tuberculosis infection：Concordance，discordance or confusion[J]. Clin Microbiol Infect，2011，17（6）：806-814.

[6] Lalvani A. Diagnosing tuberculosis infection in the 21st century：New tools to tackle an old enemy[J]. Chest，2007， 131（6）：1898-1906.

[7] 中華醫(yī)學(xué)會(huì). 臨床診療指南-結(jié)核病分冊(cè)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：64-86.

[8] 胡勇，楊唐斌. 兩種結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)試驗(yàn)比較[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2014，18（12）：2058.

[9] 楊紹基，任紅. 傳染病學(xué)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：214.

[10] World Health Organization，Global Tuberculosis Report 2014[M]. Geneva：World Health Organization，2014：282.

[11] 陸再英，鐘南山. 內(nèi)科學(xué)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：48.

[12] 王蘭蘭，許化溪. 臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：271-272.

[13] 榮蘭香，馬淑紅，艾清，等. T.SPOT-TB試驗(yàn)與PPD試驗(yàn)對(duì)結(jié)核病患者診斷價(jià)值相關(guān)性比較[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2013，17（8）：1476.

[14] Steingart KR，F(xiàn)lores LL，Dendukuri N，et al. Commercial serological tests for the diagnosis of active pulmonary and extrapulmonary tuberculosis：An updated systematic review and meta-analysis[J]. PLo S Med，2011，8（8）：e1001062.

[15] 劉旭暉，肖和平. γ-干擾素釋放試驗(yàn)（IGRA）對(duì)于診斷結(jié)核分枝桿菌感染的應(yīng)用[J]. 臨床肺科雜志，2009，14（5）：672-674.

[16] Dr Madhukar Pai，Lee W Riley，et al. Interferon-γ assays in the immunodiagnosis of tuberculosis：A systematic review[J]. The Lancet Infectious Diseases，2004，4（12）：761-776.

[17] 李曉非，李明武，蘇俊華. 體外γ-干擾素檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌不同方法的應(yīng)用價(jià)值比較[J]. 中華醫(yī)學(xué)感染學(xué)雜志，2012，22（13）：2952.

[18] 高孟秋，劉菲，紀(jì)濱英，等. 兩種γ-干擾素釋放分析在結(jié)核病臨床診斷中的比較研究[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2012，35（10）：762-765.

[19] 鄭建洲，王亞楠，俞小衛(wèi). 兩種γ-干擾素釋放試驗(yàn)診斷結(jié)核病的性能比較[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志，2013，31（7）：556-557.

[20] 章旭夢(mèng)，周華，符一騏，等. γ-干擾素釋放試驗(yàn)在活動(dòng)性結(jié)核病診斷中的臨床價(jià)值[J]. 臨床結(jié)核與呼吸雜志，2014，37（5）：372-373.

（收稿日期：2015-05-26）