陳靜怡等

摘 要：為了高效、充分、合理地利用畜骨資源，以新鮮羊骨為原料，骨粉得率為考察指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)分析來探究不同因素對羊骨粉得率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：冷凍溫度-80℃，脫脂時(shí)間4h，脫脂轉(zhuǎn)速400r/min，酶用量1.2g，酶解時(shí)間4h，酶解加水量200ml，酶解溫度45℃時(shí)，骨粉得率最高，可達(dá)83.34%。營養(yǎng)學(xué)分析結(jié)果顯示：鈣含量為12%-16%，磷含量為2%-4%，氨基酸含量24.58%-26.14%。

關(guān)鍵詞：羊骨；低溫冷凍；酶解；正交

我國是一個(gè)畜牧大國，畜禽總產(chǎn)量和消耗量一直在不斷增長，穩(wěn)居世界前列[1]。畜禽骨約占其體重的20%-30%左右[2]，是一種營養(yǎng)價(jià)值極高，廉價(jià)易得的肉類加工副產(chǎn)物。羊骨性味肝溫，具有補(bǔ)腎、強(qiáng)筋的作用，可用于減輕血小板減少性子癜，再生不良性貧血、筋骨疼痛等癥狀[3，4]。研究證實(shí)，羊骨具有極高的營養(yǎng)價(jià)值，其含有與肉類相似的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和易被人體吸收的最佳鈣、磷比例的鈣磷鹽[5，6]，并可作為血色素鐵良好的補(bǔ)充源[7]。羊骨中含有的膠原蛋白和軟骨素的成分占總蛋白質(zhì)含量的90%以上，此外還含有豐富的礦物質(zhì)、維生素、骨膠和軟骨素等[8]。羊骨中富含多種天然營養(yǎng)成分，是一種天然的表面活性劑，它不僅在食品行業(yè)逐漸成為一個(gè)獨(dú)特的新的食物源，在工業(yè)、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等產(chǎn)業(yè)上，同樣具有較高的科學(xué)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益[9，10]。我國對于羊骨的開發(fā)利用起步較晚，開發(fā)方向也局限在羊骨多肽和螯合鈣上[11]。骨類原料在實(shí)際加工生產(chǎn)過程中，因其質(zhì)地組成不同、硬度不一，后期粉碎較難控制，所以骨的細(xì)度一直受到廣泛關(guān)注[12]。Field的研究表明，110μm以下的骨?？梢员蝗梭w胃液溶解，骨粉的生產(chǎn)關(guān)鍵是使骨的粒度達(dá)到110μm以下，因此本試驗(yàn)選用200目骨粉得率作為考察指標(biāo)[13]。目前國內(nèi)對骨粉的加工方法主要有以下幾種：高溫蒸煮法；低溫冷凍法；化學(xué)水解法；酶處理水解法等[14]。單一的加工方法很難合理有效利用羊骨資源，綜合考慮不同加工方法的優(yōu)缺點(diǎn)，文章采用低溫冷凍和酶解相結(jié)合的方法加工羊骨資源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

羊腿骨：購買于周谷堆批發(fā)市場。

中性蛋白酶（20萬μg/g）：上海佳和生物科技有限公司；

EDTA，NaOH，HCl，HNO3，HClO4，H2SO4），CaCO3，NaSO3，KH2PO4，鈣羧酸，鉬酸銨，對苯二酚，乙酸乙酯等化學(xué)試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

TP-3000電子天平：湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；超微粉碎機(jī)：北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司；超低溫冰箱：中科美菱有限公司；數(shù)據(jù)恒溫水浴鍋：江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；HJ-5多功能攪拌器：金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠；GZX-9070 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；標(biāo)準(zhǔn)篩（100目，200目）：浙江上虞市水仙儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器：金壇市杰瑞而電器有限公司；氨基酸自動(dòng)分析儀L-8900：日立公司；紫外可見分光光度計(jì)：752型，上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程（見圖1）

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方案

準(zhǔn)確稱取50.00g冷凍后粗粉碎的碎骨于兩個(gè)錐形瓶中，按照“1.3.1”的工藝流程加工處理羊腿骨?？疾烀撝c酶解的先后順序、冷凍溫度、脫脂時(shí)間、脫脂轉(zhuǎn)速、酶用量、酶解時(shí)間、酶解骨水比、酶解溫度對羊骨粉得率的影響。實(shí)驗(yàn)過程中，采用控制變量法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，一般控制條件為：先脫脂后酶解、冷凍溫度-25℃，，脫脂時(shí)間5h，脫脂轉(zhuǎn)速300r/min，中性蛋白酶酶量1g，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間4h，酶解加水量200ml。對單因素最佳實(shí)驗(yàn)條件下的骨粉進(jìn)行營養(yǎng)學(xué)分析。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇酶解時(shí)間，酶解溫度和脫脂時(shí)間三個(gè)因素采用L（3）正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行正交優(yōu)化，因素水平見表1。

表1 因素水平表

1.3.3 計(jì)算與分析方法

200目骨粉得率=■×100%

M：骨粉的總質(zhì)量；M1：100目以上的骨粉質(zhì)量；M2：200目以上骨粉的質(zhì)量。

鈣含量測定：高猛酸鉀法[15]。

磷含量測定：分光光度法[15]。

氨基酸測定：氨基酸自動(dòng)分析儀法[15]。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 脫脂與酶解先后順序?qū)欠鄣寐实挠绊?/p>

脫脂和酶解的先后順序?qū)欠鄣寐实挠绊懸妶D2。

由圖2可知，先脫脂后酶解的骨粉得率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于先酶解后脫脂，原因可能是因?yàn)轷r羊骨先脫脂后，脂肪去除，酶解過程中，酶能和底物充分接觸，能有效的水解鮮骨表面的一些肌肉蛋白組織，使其分解成更小的多肽鏈或氨基酸，從而達(dá)到更好的分離效果。

2.1.2 冷凍溫度對骨粉得率的影響

冷凍溫度對骨粉得率的影響見圖3。

由圖3可知，冷凍-80℃的羊骨粉得率為64.78%，明顯高于冷凍-25℃的羊骨粉得率。鮮骨在超低溫情況下，骨細(xì)胞內(nèi)外都會(huì)形成冰晶，造成細(xì)胞脫水、皺縮，使細(xì)胞膜類脂蛋白復(fù)合物變性，加大了對骨細(xì)胞的破壞；同時(shí)溫度越低，玻璃化轉(zhuǎn)變形態(tài)更迅速、徹底，內(nèi)部組織結(jié)合力越弱，在相同的外部作用力下，粉碎效果更好。

2.1.3 脫脂時(shí)間對骨粉得率的影響

脫脂時(shí)間對骨粉得率的影響如圖4所示。

由圖4可知，隨著脫脂時(shí)間的增加，羊骨粉得率呈上升趨勢，在脫脂時(shí)間為5h時(shí)，達(dá)到最大得率，而后開始下降。分析原因，開始時(shí)隨著脫脂時(shí)間的增加，在乙酸乙酯的作用下，粗骨粉中的脂肪得到進(jìn)一步的去除，超微粉碎后過篩更加容易，減少了骨粉的損失，增加了得率。隨著脫脂時(shí)間的繼續(xù)增加，骨中蛋白質(zhì)等其它營養(yǎng)成分開始流失，骨粉得率下降。

2.1.4 脫脂轉(zhuǎn)速對骨粉得率的影響

脫脂轉(zhuǎn)速對骨粉得率的影響如圖5所示。

由圖5可知，隨著脫脂轉(zhuǎn)速的增加，羊骨粉的得率不斷增加，達(dá)到400r/min時(shí)達(dá)到最大，而后基本不變。分析原因，隨著轉(zhuǎn)速的增加，顆粒之間摩擦程度加大，更有利于脫脂的進(jìn)行。因此，脫脂轉(zhuǎn)速控制在400r/min。

2.1.5 酶用量對骨粉得率的影響

酶用量對骨粉得率的影響如圖6所示。

由圖6可知，酶用量在1.2g時(shí)，骨粉得率最高，在兩邊區(qū)域，提取率均有所降低。分析其原因，中性蛋白酶是一種生物催化劑，和底物的反應(yīng)有一定的飽和度。隨著酶用量的增加，酶與底物的結(jié)合是逐漸飽和的，因此提取率不斷提高；然而，當(dāng)酶用量達(dá)到最大飽和值后，羊骨中蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分開始流失，骨粉得率下降。

2.1.6 酶解時(shí)間對骨粉得率的影響

酶解時(shí)間對骨粉得率的影響如圖7所示。

由圖7可知，酶解時(shí)間為4h時(shí)骨粉得率最大。酶解時(shí)間繼續(xù)延長時(shí)，骨粉得率反而略有下降。原因是開始隨著酶解時(shí)間的增加，中性蛋白酶作用不斷增強(qiáng)，到達(dá)一定時(shí)間酶促反應(yīng)已經(jīng)基本完成，同時(shí)還保留有較多的羊骨中的有效成分，但隨著時(shí)間的進(jìn)一步增加，羊骨中的有效成分也被會(huì)逐漸被酶降解而使得率下降。

2.1.7 酶解加水量對骨粉得率的影響

酶解加水量對骨粉得率的影響如圖8所示。

由圖8可知，開始隨著酶解加水量的增加，羊骨得率逐漸增加，加水量達(dá)到200ml時(shí)達(dá)到最大得率。分析原因，隨著加水量的增加，粗骨粉與酶接觸的比表面積增加，能達(dá)到更好的酶解效果，隨著加水量的繼續(xù)增加，可能會(huì)導(dǎo)致中性蛋白酶對粗骨粉的附著力降低，酶解效果不佳，使得得率略有下降。因此，單因素實(shí)驗(yàn)中確定的最佳酶解加水量為200ml。

2.1.8 酶解溫度對骨粉得率的影響

酶解溫度對骨粉得率的影響如圖9所示。

由圖9可以看出，隨著溫度的增加，酶促反應(yīng)加快，骨粉得率不斷提高；45℃時(shí)，得率最高，而后隨著溫度的繼續(xù)升高而下降。酶是一種生物催化劑，其反應(yīng)有最適反應(yīng)溫度，溫度過低或過高，都會(huì)導(dǎo)致酶促反應(yīng)速率下降或者酶失活，進(jìn)而影響骨粉得率。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知：根據(jù)極差分析確定因素對實(shí)驗(yàn)指標(biāo)影響的主次順序是B>C>A，即酶解溫度對骨粉200目得率影響最大，其次是脫脂時(shí)間，而酶解時(shí)間對羊骨粉得率的影響最小。根據(jù)因素水平k值確定優(yōu)組合為A2B2C2，即理想的超微羊骨粉制備最優(yōu)工藝為酶解時(shí)間4h，酶解溫度45℃，脫脂時(shí)間4h，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明羊骨粉得率可以達(dá)到83.34%。

2.3 骨粉營養(yǎng)學(xué)分析

氨基酸自動(dòng)分析儀分析測得牛骨粉中氨基酸含量為24.58%-26.14%，其中必須氨基酸3.58%-3.86%。分光光度法測定磷含量2-4%，高猛酸鉀法測得鈣含量12%-16%，各項(xiàng)指標(biāo)均較好。

3 結(jié)論與分析

文章以新鮮羊骨為原料，以200目骨粉得率為考察指標(biāo)，采用低溫冷凍和酶解相結(jié)合的方法處理加工羊骨，考察不同因素對羊骨粉得率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：先脫脂后酶解，冷凍溫度-80℃，脫脂時(shí)間4h，脫脂轉(zhuǎn)速400r/min，酶用量1.2g，酶解時(shí)間4h，酶解加水量200ml，酶解溫度45℃時(shí)，骨粉得率最高，可達(dá)83.34%。營養(yǎng)學(xué)分析結(jié)果顯示：鈣含量為12%-16%，磷含量為2%-4%，氨基酸含量24.58%-26.14%。

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作者簡介：陳靜怡（1991-），女，漢族，安徽潁上人，碩士生，主要從事生物化學(xué)、食品生化研究。

*通訊作者：肖厚榮