孟煜+唐婉瑩+韓士群

摘要：為探索蘆葦資源化利用──生成低聚木糖的方法，采用蒸汽爆破預(yù)處理蘆葦秸稈再輔以酶解制取低聚木糖的方式，分別考察不同壓力下直接爆破及加堿處理爆破的汽爆效果，同時(shí)探究最佳預(yù)處理物料制備低聚木糖的酶解條件。研究結(jié)果表明，蒸汽爆破可以有效破壞蘆葦纖維形態(tài)，加堿爆破的蘆葦纖維斷裂更為明顯；加堿爆破后還原糖、可溶性總糖、低聚木糖溶出量較低，但木聚糖的含量相對(duì)較高，更為適合低聚木糖的生產(chǎn)。選取加堿爆破蘆葦原料生產(chǎn)低聚木糖的最佳酶解條件為固液比1 g ∶10 mL、溫度45 ℃、pH值4.8、加酶量5%（占蘆葦干物質(zhì)量比）、酶解時(shí)間 24 h，所得低聚木糖可達(dá)蘆葦干物質(zhì)量的14.0%；在最佳酶解條件下，得到的低聚木糖主要成分為木二糖，在24 h達(dá)到最大值，占蘆葦干物質(zhì)量的12.3%；同時(shí)還含有少量的木三糖，含量在18 h達(dá)到最大值，可達(dá)到蘆葦干物質(zhì)量的1.7%。

關(guān)鍵詞：蘆葦；資源化利用；蒸汽爆破；酶解；低聚木糖

中圖分類號(hào)：S564+.201 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）11-0445-05

我國(guó)目前擁有大量蘆葦資源，太湖就有超過100 km的岸線生長(zhǎng)蘆葦。據(jù)王丹等報(bào)道，太湖濕地整個(gè)生長(zhǎng)季，蘆葦?shù)厣仙锪孔畲笾的苓_(dá)到2 219.46 g/m2。但絕大部分蘆葦收割后無處利用被肆意堆放，或者被大量焚燒，造成嚴(yán)重的環(huán)境問題[1]。相關(guān)研究表明，蘆葦中主要成分為棕纖維素和木質(zhì)素，木聚糖能占到棕纖維素含量的30%左右，可作為低聚木糖的生產(chǎn)原料[2]。眾多學(xué)者都進(jìn)行了制備低聚木糖的研究，許曉燕等進(jìn)行了從花生殼中制取低聚木糖的相關(guān)研究[3]，段永忠等探究了利用甘蔗渣制取低聚木糖的方法[4]，王遠(yuǎn)等從麥麩中成功得到了低聚木糖[5]，但是關(guān)于利用蘆葦原料制取低聚木糖的方法還未見相關(guān)報(bào)道。

關(guān)于從農(nóng)林植物中提取木聚糖的研究，Sasaka提出用直接高溫蒸煮提取法來制取木聚糖提取液，但其中副反應(yīng)較多，提取液中還原糖與總糖之比較低，不利于低聚木糖的生產(chǎn)[6]；劉寶亮等采用稀堿溶液浸泡或者同時(shí)將浸泡液升高到一定溫度來提取木聚糖，但此方法需要耐腐蝕的設(shè)備，還需要解決堿水廢液污染環(huán)境的問題，生產(chǎn)成本較高[7]；邵佩蘭等采用稀酸溶液一定溫度預(yù)浸后高溫蒸煮的方式來制取木聚糖[8]，但是酸法提取也存在較大缺點(diǎn)，副反應(yīng)較多，不易于控制調(diào)節(jié)反應(yīng)程度，易產(chǎn)生糠醛等雜質(zhì)，不利于產(chǎn)品后續(xù)精制提純。蒸汽爆破能在不添加多余化學(xué)藥品的情況下將木聚糖從從植物纖維中有效分離出來，大大提高酶解制取低聚木糖的效率[9]。目前，蒸汽爆破處理結(jié)合酶法[10-14]生產(chǎn)低聚木糖是研究的重點(diǎn)。

本研究采用蒸汽爆破預(yù)處理提取木聚糖的方法，以爆破后蘆葦秸稈為原料，使用渣液混合加酶水解的方法生產(chǎn)低聚木糖，對(duì)蒸汽爆破預(yù)處理?xiàng)l件及水解相關(guān)參數(shù)進(jìn)行研究，以還原糖量、可溶性總糖量、水解率、平均聚合度（DP）來綜合評(píng)價(jià)酶解過程。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合高效液相色譜來準(zhǔn)確分析酶解液中低聚木糖含量，為蘆葦工業(yè)化利用提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蘆葦原料來自于蘇州太湖，自然條件下風(fēng)干，粉碎至 3～8 cm；酶解原料：蘆葦在一定壓力下蒸汽爆破所得；內(nèi)切木聚糖酶，南京奧多福尼生物科技有限公司，酶活為6.0×104 U/g；木糖標(biāo)準(zhǔn)品，上海晶純生化科技股份有限公司；木二糖、木三糖標(biāo)準(zhǔn)品，日本和光純藥工業(yè)株式公社；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

自制蒸汽爆破設(shè)備，主要由蒸汽發(fā)生器、汽爆罐和接收器組成；S-4800透射電鏡（SEM），賽默飛世爾科技公司；722N可見分光光度計(jì)，上海科學(xué)精密儀器有限公司；高效液相色譜儀（配備2414示差折光檢測(cè)器），Waters科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘆葦蒸汽爆破處理

將經(jīng)過粉碎的蘆葦秸稈連續(xù)加入到自制蒸汽爆破機(jī)中，在一定壓力的蒸汽爆破機(jī)中維壓 15 min 后瞬間泄壓出料，所得爆破物料經(jīng)烘干處理后備用。

1.3.2 蘆葦蒸汽爆破酶解液制備

將蒸汽爆破后烘干的蘆葦樣品經(jīng)植物粉碎機(jī)粉碎，過100目篩，按對(duì)應(yīng)于汽爆蘆葦不同的料液比加入去離子水，用檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH值，然后加入一定量的內(nèi)切木聚糖酶（以相對(duì)于絕干蘆葦?shù)馁|(zhì)量百分比計(jì)）在一定溫度的水浴鍋中進(jìn)行酶解反應(yīng)。酶解一段時(shí)間后，沸水浴15 min滅酶，待冷卻后經(jīng)布氏漏斗抽濾并洗滌濾餅3次，把所得液體轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中并定容至刻度，得到蘆葦酶解液。

1.3.3 酶水解因素條件篩選

選取固液比、溫度、初始pH值、加酶量、酶解時(shí)間5個(gè)因素，通過測(cè)定還原性糖、總糖、低聚木糖含量及計(jì)算水解率、聚合度（DP）來確定最佳酶解條件。

1.3.3.1 固液比

在固定加酶量5%（相對(duì)于蘆葦干物質(zhì)量）、pH值5.0、溫度50 ℃、酶解時(shí)間24 h酶解條件下，研究固液比分別為1 ∶8、1 ∶9、1 ∶10、1 ∶11、1 ∶12（g ∶mL）對(duì)酶解效果的影響。

1.3.3.2 溫度

在固定固液比1 g ∶10 mL、加酶量5%、pH值5.0、酶解時(shí)間24 h條件下，研究溫度分別為35、40、45、50、55 ℃對(duì)酶解效果的影響。

1.3.3.3 初始pH值

將固液比固定為1 g ∶10 mL、加酶量5%、溫度固定為50 ℃、酶解時(shí)間24 h，分別考察pH值分別為4.4、4.6、4.8、5.0、5.2對(duì)酶解效果的影響。

1.3.3.4 加酶量

保持固液比1 g∶10 mL、pH值5.0、溫度50 ℃、酶解時(shí)間24 h，研究加酶量分別為1%、3%、5%、7%對(duì)酶解效果的影響。

1.3.3.5 酶解時(shí)間

在保持固液比1 g ∶10 mL、pH值5.0、溫度50 ℃、加酶量5%的條件下，研究酶解時(shí)間分別為6、12、18、20、24、26、28 h對(duì)酶解效果的影響。

1.4 分析方法

1.4.1 蘆葦汽爆物料掃描電鏡分析

將汽爆條件分別為 1.20、1.35、1.40、1.50、1.40 MPa加14%堿下爆破得到的蘆葦物料干燥后進(jìn)行掃描電鏡分析。

1.4.2 木聚糖含量測(cè)定

地衣酚-鹽酸法[15]測(cè)定木聚糖含量。

1.4.3 酶解液中還原糖（RS）含量測(cè)定

3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS法）[16]測(cè)定還原糖含量（以木糖計(jì)）。

1.4.4 酶解液中可溶性總糖（TS）含量測(cè)定

苯酚-硫酸法[17-18]測(cè)定可溶性總糖含量。

1.4.5 水解率、平均聚合度（DP）的計(jì)算

水解率=不同反應(yīng)時(shí)間樣品還原糖量初始樣品總糖含量-初始還原糖量×100%；

平均聚合度（DP）=提取液可溶性總糖含量提取液還原糖含量×100%（用玉米芯等作物含有的木聚糖來制取低聚木糖時(shí)，最佳聚合度一般控制在1.7～1.8[19]）。

1.4.6 低聚木糖含量測(cè)定

高效液相色譜法[20]（HPLC）色譜條件：色譜柱：SHODEX UGAR KS-802，300 mm×8 mm×6 μm；流動(dòng)相：高純水；柱溫：80 ℃；示差檢測(cè)器溫度：water2414檢測(cè)器，溫度50 ℃；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

[BT1+*5]2 結(jié)果與分析

2.1 不同汽爆條件對(duì)蘆葦纖維及糖溶出的影響

從圖1-A可以看出，未經(jīng)任何處理的蘆葦原料纖維致密緊實(shí)，表面排列較有規(guī)律。通過圖1-A與圖1-B、圖1-C、圖1-D、圖1-E的圖片對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過蒸汽爆破預(yù)處理后，蘆葦纖維由原先較為平整光滑變?yōu)槎嗵幊霈F(xiàn)斷裂，參差不齊；通過圖1-B、圖1-C、圖1-E的圖片對(duì)比還可以發(fā)現(xiàn)，爆破蒸汽壓力從1.20 MPa增加至1.50 MPa，蘆葦纖維斷裂程度越來越深；同時(shí)，通過圖1-C、圖1-D圖片對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，在相同壓力1.40 MPa條件下，加堿爆破后蘆葦纖維斷裂程度更加明顯。

不同汽爆預(yù)處理測(cè)定物料中木聚糖、可溶性總糖、還原性糖、低聚木糖含量見圖2。隨著蒸汽爆破壓力從1.20 MPa增大至1.50 MPa，還原糖、可溶性總糖、低聚木糖、木聚糖含量都隨之增加。同時(shí)，還可以發(fā)現(xiàn)1.40 MPa加堿爆破后還原糖、可溶性總糖含量較低，但加堿爆破可以得到更多的游離木聚糖，達(dá)16.03%，更有利于后續(xù)酶解產(chǎn)生低聚木糖。

2.2 爆破蘆葦物料酶水解條件

2.2.1 固液比

從圖3可以看出，隨著固液比的增加，總糖、低聚木糖含量都是先增加后下降，還原性糖雖然在增加，但不太明顯，這可能是由于低聚木糖酶優(yōu)先水解長(zhǎng)鏈木聚糖，產(chǎn)生木四糖、木五糖或者更長(zhǎng)鏈的木聚糖。從圖4可以看出，隨著固液比的增加，水解率先增大后減小，在固液比1 g ∶10 mL時(shí)達(dá)到最大值，為51.28%，此時(shí)聚合度（DP）達(dá)到1.7，在最佳生產(chǎn)低聚木糖范圍內(nèi)。綜上所述，選擇固液比1 g ∶10 mL作為最佳酶解條件。

2.2.2 酶解溫度

從圖5、圖6可以看出，可溶性總糖、還原糖、低聚木糖含量和水解率均隨溫度升高表現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到45 ℃時(shí)達(dá)到峰值，分別為 25.56%、14.04%、20.08%、51.84%，聚合度在45 ℃時(shí)達(dá)到1.8，在最佳生產(chǎn)低聚木糖的范圍內(nèi)。因此，45 ℃是最佳的酶解溫度。

2.2.3 酶解液pH值

從圖7、圖8可以看出，還原糖、可溶性總糖、低聚木糖的含量及水解率的數(shù)值均隨初始pH值升高表現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)體系初始pH值為4.8時(shí)數(shù)值達(dá)到峰值，分別為24.59%、13.92%、19.00%、51.28%，在45 ℃時(shí)聚合度為1.8，也在最佳生產(chǎn)低聚木糖的聚合度范圍內(nèi)。因此，pH值為4.8是最佳初始條件。

2.2.4 加酶量

從圖9、圖10可以看出，隨著加酶量的增加，還原糖、總糖、低聚木糖含量都在上升，當(dāng)加酶量從5%增至7%時(shí)，可溶性總糖含量略有增加，還原糖含量反而有所下降， 同時(shí)低聚木糖含量也略有下降。水解率也隨著加酶量的增加而上升，當(dāng)加酶量為7%時(shí)水解率比5%有所下降。因此，5%為合適的酶添加量。

2.2.5 酶解時(shí)間的影響

從圖11、圖12可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖、總糖、低聚木糖含量在持續(xù)增加，三者都在酶解時(shí)間為24 h時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)的聚合度為1.7，在適合生產(chǎn)低聚木糖的聚合度范圍內(nèi)，24 h以后總糖、還原糖含量基本沒有增加，低聚木糖含量反而有所下降，這可能是低聚木糖水解成單糖，這不利于低聚木糖的生產(chǎn)，因此，24 h是最佳的酶解時(shí)間。

選取最佳酶解條件即固液比1 g ∶10 mL、溫度50 ℃、初始pH值4.8、加酶量5%、酶水解時(shí)間24 h為優(yōu)化條件進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定酶解液中糖含量，結(jié)果還原糖含量為 3.51 mg/mL，可溶性總糖含量為6.39 mg/mL，此時(shí)平均聚合度為1.8，在最佳生產(chǎn)低聚木糖的DP范圍內(nèi)；同時(shí)采用HPLC分析酶解液中各物質(zhì)組分，圖譜結(jié)果見圖13，酶解液中低聚木糖含有較多木二糖和少量木三糖， 分別占樣品含量的 12.3%、1.7%，低聚木糖的含量占蘆葦干物質(zhì)量的14.0%，占可溶性總糖含量的54.9%。

2.3 最佳酶解條件下時(shí)間對(duì)低聚木糖各組分的影響

選取最佳酶解條件pH值4.8、加酶量5%、固液比 1 g ∶10 mL、酶解溫度50 ℃，時(shí)間選取6、12、18、20、24、26、28 h 7個(gè)時(shí)段，采用高效液相色譜法分別測(cè)定低聚木糖各組分的含量（圖14）。從圖14可以看出，蘆葦物料蒸汽爆破加酶水解后得到的低聚木糖中只含有木二糖、木三糖，木二糖含量遠(yuǎn)高于木三糖，表明此酶解方法較適合生產(chǎn)單一低聚木糖——木二糖。

木二糖含量隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，表現(xiàn)先增加后減少，在24 h時(shí)達(dá)到最大值，占干物質(zhì)量的14.05%，24 h后含量下降；木三糖含量比木二糖含量少，在12 h基本達(dá)到最大值，從12～24 h增加了0.13%，24 h后含量緩慢下降。低聚木糖只含有木二糖和木三糖，低聚木糖的含量就是二者之和。低聚木糖含量在24 h時(shí)達(dá)到最大值，占干物質(zhì)量的14.05%。

3 討論與結(jié)論

低聚木糖是一種具有優(yōu)異生理學(xué)性能和高附加值的新興功能性低聚糖產(chǎn)品，目前，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、功能性食品、飼料添加劑等方面[21-23]。楊瑞金等采用干法和濕法蒸煮處理玉米芯連渣一起酶解生產(chǎn)低聚木糖[24]，李里特等以蒸汽噴爆法預(yù)處理玉米芯得到的汽爆液生產(chǎn)低聚木糖[25]。本研究使用廢棄蘆葦秸稈為原料生產(chǎn)低聚木糖，不僅使生產(chǎn)低聚木糖的原料范圍更加寬闊，而且大大節(jié)約了成本。

蒸汽爆破的目的是將物料半纖維素中的木聚糖盡可能與其他物質(zhì)分開，部分水解游離出來，使之能充分地與木聚糖酶接觸，提高酶解的效率與產(chǎn)物收率[25]。試驗(yàn)結(jié)果表明，蒸汽爆破可以有效破壞蘆葦物料表面形態(tài)特征，更有利于與酶進(jìn)行接觸。傳統(tǒng)酶法制備低聚木糖一般先用堿將木聚糖提取出來然后酶法水解，需要消耗原料干質(zhì)量60%～120%的堿和較長(zhǎng)的提取時(shí)間，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生大量堿液[26-27]。堿性汽爆相比于一般預(yù)處理方式更有利于生產(chǎn)低聚木糖，蘆葦物料在堿的作用下木聚糖側(cè)鏈乙酰基斷裂，木聚糖以大分子的形式游離出來，因此產(chǎn)生游離單糖較少，更有利于酶解。本研究中選用14%的用堿量進(jìn)行蒸汽爆破，只需消耗 15 min，爆出物料廢液較少，在最佳條件（固液比1 g ∶10 mL、溫度45 ℃、pH值4.8、加酶量5%、酶解時(shí)間24 h）下酶解后，低聚木糖得率能達(dá)到14.0%，且低聚木糖中主要含有木二糖，占干物質(zhì)量的12.3%，還含有少量木三糖，占干物質(zhì)量的1.7%。本試驗(yàn)還在此基礎(chǔ)上研究了酶解后低聚木糖單一組分含量隨時(shí)間的變化規(guī)律，為生產(chǎn)單一組分低聚木糖提供了依據(jù)，填補(bǔ)了同類研究的空白。

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