張玉琴等

【摘 要】 目的：研究海風(fēng)藤正丁醇提取物對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織中NF-κB、IκB和IκK的影響，探討其治療作用機(jī)制。方法：通過建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA） 大鼠模型，觀察大鼠足趾腫脹度的變化，蛋白印跡法檢測大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中NF-κB、IκB和IκK的表達(dá)水平。結(jié)果：海風(fēng)藤正丁醇提取物能改善大鼠活動(dòng)減少、精神不佳等一般狀態(tài)，下調(diào)滑膜組織中 NF-κB、IκK的表達(dá)及上調(diào)滑膜組織中IκB的表達(dá)。結(jié)論：海風(fēng)藤正丁醇提取物對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有一定的治療作用，其機(jī)理與調(diào)節(jié)滑膜組織中NF-κB、IκB和IκK的表達(dá)水平有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 海風(fēng)藤；膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎；NF-κB；IκB；IκK

【中圖分類號(hào)】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2015）07-0019-02

Abstract：Objective To investigate the therapeutic effect of Piperis kadsurae caulis extraction on collagen-induced rheumatoid arthritis rats， and its effects on NF-κB， IκB and IκK in synovial tissue， and to explore its therapeutic mechanism.Methods CIA rat model was induced by injecting bovine type II collagen.The swelling level of paw was observed and the expression of NF-κB， IKB and IκK were evaluated by Western blotting.Results The ethyl acetate extraces of Piperis kadsurae caulis could inhibit the paw swelling and down-regulate the expression of NF-κB，IκB and IκK.Conclusion The ethyl acetate extraces of Piperis kadsurae caulis have certain therapeutic on rheumatoid arthritis by reducing the expression of NF-κB， IκB and IκK in synovial tissue.

Keywords：Piperis kadsurae caulis；collagen-induced rheumatoid arthritis；NF-κB；IκB；IκK

海風(fēng)藤是胡椒科植物風(fēng)藤（Piper kadsura （Choisy） Owchi.）的干燥藤莖，辛、苦，微溫，具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、止痹通等功效[1]。目前，已有研究者初步發(fā)現(xiàn)海風(fēng)藤正丁醇部位具有一定的抗炎作用[2]。本實(shí)驗(yàn)通過建立CIA模型，觀察海風(fēng)藤正丁醇提取物對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠足趾腫脹度的變化及滑膜組織中NF-κB、IκB和IκK的含量的影響，在一定程度上探討其防治RA的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠，6周齡，體重200±20g，雄性，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXX（滬）2008-0005。福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供SPF級(jí)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施，使用許可證號(hào)：SYXK（閩）2009-0001。

1.2 藥品與試劑 海風(fēng)藤購自福州回春中藥飲片廠有限公司，批號(hào)130928；雷公藤多苷片（黃石飛云制藥有限公司，批號(hào)：20110501）；完全弗氏佐劑（CFA，美國Sigma公司，批號(hào)：F-5503）；牛Ⅱ型膠原（美國Sigma公司，批號(hào)：C-20022）；NF-κB、IκB和IκK一抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；二抗及相應(yīng)試劑（廈門鷺隆生物有限公司）。

1.3 儀器 SE202F電子天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）；YLS-7B足趾容積測量儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）。

2 方法

2.1 藥物的制備 取海風(fēng)藤7kg，用70 %乙醇回流提取3次，每次1.5h，合并提取液，回收乙醇，得到乙醇提取物。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，浸膏加水混懸后，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，回收溶劑后蒸干得到正丁醇部位 377.37g。灌胃前正丁醇部位用0.5% CMC-Na混懸。

2.2 CIA大鼠模型的建立與給藥方法 將50只Wistar大鼠隨機(jī)分為5組：正常組、模型組、陽性對(duì)照組（雷公藤多苷片）、正丁醇低劑量組、正丁醇高劑量組，每組為各10只，根據(jù)文獻(xiàn)方法進(jìn)行造模[3-4]。即將完全弗氏佐劑（CFA）與2mg/ml 的牛Ⅱ型膠原乳液等體積混合，制成膠原乳劑，除正常組外，每只大鼠尾根部皮內(nèi)注射膠原蛋白0.2mg。于第7 天進(jìn)行第2次免疫，除正常組外，每只大鼠尾根部皮內(nèi)注射膠原乳劑0.1mg（不完全弗氏佐劑（IFA）與2mg/ml的牛Ⅱ型膠原乳液等體積混合，制成膠原乳劑）。初次免疫后第1天開始分組給藥，每日灌胃給藥1次。正常組、模型組每日給予9.0g/L氯化鈉注射液10ml/kg；高劑量組灌胃給予30.88mg/kg，低劑量組每日灌胃給予7.72mg/kg，雷公藤多苷組給予6mg/（kg·d）。連續(xù)給藥28d。

2.3 蛋白印跡法測定NF-κB、IκB和IκK的表達(dá) 根據(jù)文獻(xiàn)方法[5]，提取大鼠雙后膝關(guān)節(jié)滑膜組織蛋白，4℃離心5min，取上清，分裝，保存于-20℃冰箱，待用。取適量樣品，加入等體積5×蛋白上樣緩沖液，100℃金屬浴10min。各組取20μg進(jìn)行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。將分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶室溫封閉2h，分別加入5 %脫脂奶配制的一抗[β-actin（1∶1000）、NF-κB（1∶1000）、IκB （1∶1000）、IκK （1∶1000）]，4℃過夜。TBST洗3×10min，加入5%脫脂奶配制的二抗（1∶7000）室溫孵育2h，TBST洗3×10min，ECL發(fā)光顯影。讀取灰度值，比較每組NF-κB、IKB和IκK灰度值/β-actin灰度值的平均值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均用x[TX-*3]±s表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)CIA模型大鼠一般癥狀的影響 模型組大鼠于造模后第10天表現(xiàn)為足趾和踝關(guān)節(jié)開始出現(xiàn)腫脹，并日漸加重，食欲下降，體重減輕，活動(dòng)減少，精神不佳，部分大鼠右后足出現(xiàn)足趾變形，無死亡情況；陽性對(duì)照組及給藥組大鼠治療后上述癥狀均有明顯緩解。

3.2 鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中NF-κB、IκB和IκK的蛋白表達(dá) 見圖1和表1。

模型組NF-κB和IκK陽性表達(dá)與正常組相比顯著上升，而IκB陽性表達(dá)與正常組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。海風(fēng)藤正丁醇提取物低、高劑量組NF-κB、IκB和IκK陽性表達(dá)與模型組比較有明顯的改善（P<0.05或P<0.01），而且呈劑量依賴性。

4 討論

Ⅱ型膠原蛋白混合弗氏佐劑的膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型與人類類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）相似，既具有RA的急性病變，又有一定的慢性病變特征，是篩選和研究防止類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物的理想模型[6]。本實(shí)驗(yàn)采用該模型，觀察了海風(fēng)藤正丁醇部位對(duì)模型大鼠關(guān)節(jié)和滑膜組織的影響，結(jié)果表明，海風(fēng)藤對(duì)于改善CIA模型大鼠的一般病變情況包括精神狀態(tài)、活動(dòng)能力有一定的作用。

海風(fēng)藤是胡椒科植物風(fēng)藤的干燥藤莖，是一種常用的中草藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，海風(fēng)藤的乙酸乙酯部位、正丁醇部位、揮發(fā)油部位具有明顯的抗炎活性[7]，為海風(fēng)藤治療抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。臨床上，海風(fēng)藤與其他藥物配伍，大量用于治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的報(bào)道屢見不鮮[8-9]。然而，其抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)理研究還不完善。本實(shí)驗(yàn)就運(yùn)用大鼠CIA模型，初步探討了海風(fēng)藤正丁醇部位防治大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。結(jié)果表明，海風(fēng)藤正丁醇提取物能有效的調(diào)控大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中NF-κB、IκB和IκK的表達(dá)，說明其發(fā)揮抗炎作用可能是通過調(diào)節(jié)組織中NF-κB、IκB和IκK的等蛋白的表達(dá)。海風(fēng)藤正丁醇提取物對(duì)CIA模型大鼠有明顯的防治作用，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB、IκB和IκK等蛋白的表達(dá)來發(fā)揮其抗炎抗風(fēng)濕作用，從而減輕關(guān)節(jié)炎癥狀而達(dá)到治療效果，值得深入探討。

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（收稿日期：2015.01.23）