郭志凱　劉壽柏　馬帥　王蓉

摘 要 為從昆蟲(chóng)來(lái)源的放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中尋找藥物先導(dǎo)分子，對(duì)銅綠金龜子幼蟲(chóng)腸道鏈霉菌Streptomyces sp. BCa1菌絲體化學(xué)成分進(jìn)行了研究。通過(guò)活性跟蹤，從其菌絲體的氯仿甲醇萃取物中分離得到主要成分1。利用高分辨質(zhì)譜、一維和二維核磁波譜技術(shù)，將該主要成分1鑒定為具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的不飽和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素阿扎霉素（elaiophylin），具有顯著的抗金黃色葡萄球菌活性。該類化合物為首次從昆蟲(chóng)來(lái)源的放線菌中發(fā)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞 銅綠金龜子；鏈霉菌；菌體；阿扎霉素；抗菌活性

中圖分類號(hào) O629.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract In order to find drug leads from insect-associated actinomycetes，guided by antibacterial activity assay，a major bioactive constituent 1 was isolated from the organic solvent（chloroform and methanol mixture）extract of the mycelia of the cockchafer（Anomala corpulenta Motsch）-derived Streptomyces sp. BCa1. The compound was identified as elaiophylin（1）， a symmetrical macrolide antibiotic with 16-membered unsaturated dilactone ring，on the basis of spectroscopic analyses including HR-ESI-MS，1D and 2D NMR experiments. Compound 1 showed significant antibacterial activity against Staphylococcus aureus. This kind of compound was firstly reported from an insect-derived Streptomyces.

Key words Anomala corpulenta Motsch； Streptomyces sp.； Mycelia； Elaiophylin； Antibacterial activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.07.020

與昆蟲(chóng)共生等特殊生境生活著次生代謝途徑特殊的微生物[1-2]，已成為藥物先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的重要來(lái)源。昆蟲(chóng)來(lái)源的放線菌和真菌能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的活性成分如抗真菌物質(zhì)dentigerumycin[3]、mycangimycin[4-5]、sceliphrolactam[6]、resistomycin和tetracenomycin[7]，以及骨架新穎的倍半萜類的抗細(xì)菌成分[8]，昆蟲(chóng)共生菌正成為尋找結(jié)構(gòu)獨(dú)特、活性多樣性天然藥物分子的重要材料。作者曾從中華稻蝗腸道共生放線菌Amycolatopsis sp. HCa1的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)具有強(qiáng)抗腫瘤細(xì)胞活性的新型苯并蒽醌類化合物[9-10]并從其菌體中發(fā)現(xiàn)了具有免疫抑制活性的新型糖脂類化合物[11-12]。在持續(xù)篩選昆蟲(chóng)來(lái)源的微生物產(chǎn)活性成分研究中，從一株銅綠金龜子（Anomala corpulenta Motsch）幼蟲(chóng)腸道鏈霉菌Streptomyces sp. BCa1的發(fā)酵液中分離鑒定了Hsp90蛋白抑制劑格爾德霉素（geldanamycin）和萘醌型大環(huán)內(nèi)酯類化合物hygrocin A及其類似物[13]。為充分挖掘銅綠金龜子腸道鏈霉菌Streptomyces sp. BCa1產(chǎn)結(jié)構(gòu)新穎性活性分子的潛力，本研究對(duì)該菌菌體活性成分進(jìn)行了分離，從其氯仿甲醇提取物中分離純化得到化合物1，通過(guò)波譜解析以及與文獻(xiàn)對(duì)照鑒定為具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的不飽和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素阿扎霉素（elaiophylin）（圖1）。該化合物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌-金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有顯著的體外抑制活性，但對(duì)革蘭氏陰性菌-煙草青枯菌（Pseudomonas solanacearum）及白色念珠菌（Candida albicans）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4）等真菌無(wú)抑制活性。該化合物為首次從昆蟲(chóng)來(lái)源的放線菌中發(fā)現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 由Agilent 6210 TOF LC-MS質(zhì)譜儀（Agilent，美國(guó)）測(cè)定高分辨質(zhì)譜（HR-ESI-MS）數(shù)據(jù)；化合物的一維和二維數(shù)據(jù)由布魯克核磁共振波譜儀（Bruker DRX 500 MHz，德國(guó)）測(cè)定，以TMS為內(nèi)標(biāo)，化學(xué)位移以δ（ppm）表示；薄層層析硅膠（GF254）和層析柱硅膠（200～300目）均購(gòu)自青島海洋化工廠；Sephadex LH-20和ODS反相硅膠分別購(gòu)自瑞典Pharmacia Biotech和日本京都Nacalai Tesque公司；分離實(shí)驗(yàn)中使用的試劑均為重蒸后的工業(yè)用試劑。

1.1.2 菌株 放線菌Streptomyces sp. BCa1菌株為先前作者從銅綠金龜子幼蟲(chóng)腸道中分離所得[13]。

1.2 方法

1.2.1 菌株的發(fā)酵 Streptomyces sp. BCa1菌株經(jīng)高氏I號(hào)培養(yǎng)基平板（1.0 g/L KNO3，0.5 g/L MgSO4，

0.5 g/L K2HPO4，0.5 g/L NaCl，0.01 g/L FeSO4·7H2O，20 g/L可溶性淀粉，20 g/L 瓊脂）活化，28 ℃培養(yǎng) 4 d，之后接種于液體高氏I號(hào)培養(yǎng)基中，于柜式搖床120 r/min，28 ℃ 培養(yǎng)3 d作為種子液。取30 mL種子液接種至裝有400 mL液體麥芽培養(yǎng)基（20 g/L麥芽提取物，20 g/L蔗糖，1 g/L蛋白胨）的Erlenmeyer燒瓶（1 000 mL）中，共接種20瓶，于三層搖床上發(fā)酵12 d（120 r/min，28 ℃）。

1.2.2 化合物的分離和純化 將發(fā)酵物過(guò)濾后得發(fā)酵液和菌體，菌體經(jīng)等體積混合的氯仿-甲醇溶劑（3 L）于室溫下浸提7 d，超聲萃取3遍（3 L×3），合并萃取液后減壓濃縮得黃色粗提物6.9 g。該粗提物經(jīng)減壓硅膠柱色譜，以CHCl3-MeOH梯度洗脫得7個(gè)流份（v/v 100 ∶ 0，100 ∶ 1，100 ∶ 2，100 ∶ 4，

100 ∶ 8，100 ∶ 16，0 ∶ 100），經(jīng)抗金黃色葡萄球活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)其中第5個(gè)流份（CHCl3-MeOH，100 ∶ 8）具有強(qiáng)烈的抑菌活性。該流份（242.6 mg）經(jīng)ODS反相柱層析，以MeOH-H2O（v/v 40 ∶ 60，50 ∶ 50，60 ∶ 40，

70 ∶ 30，80 ∶ 20，100 ∶ 0）梯度洗脫得到6個(gè)流份，其中第3個(gè)流份（MeOH-H2O，60 ∶ 40）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析（甲醇為流動(dòng)相）得到化合物1（24.5 mg）。

1.2.3 抗菌活性測(cè)試 體外測(cè)試抗菌活性所采用的方法與先前報(bào)道的文獻(xiàn)一致[14]。供試菌株有金黃色葡萄球菌，煙草青枯菌，白色念珠菌和尖孢鐮刀菌。

2 結(jié)果與分析

化合物1，正源高分辨電噴霧質(zhì)譜顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 1047.5859[M+Na]+，推出其分子式為C54H88O18，不飽和度為11?；衔?的13C-NMR譜僅給出了27個(gè)碳信號(hào)峰，故判斷該化合物存在對(duì)稱結(jié)構(gòu)。結(jié)合其1H-NMR和DEPT135譜可以看出該化合物的27個(gè)碳信號(hào)峰分別為2個(gè)季碳、6個(gè)甲基、3個(gè)亞甲基和16個(gè)次甲基（其中8個(gè)連氧次甲基）信號(hào)峰。其中，δC 167.1的季碳顯示該分子中有酯羰基存在；δC 144.8，144.8，130.6和121.3的次甲基碳提示分子中的一半結(jié)構(gòu)上含有2個(gè)雙鍵；δC 99.2-64.9之間的碳提示該分子中含有糖環(huán)，且位于糖環(huán)上的δC 99.2和92.5的碳提示這2個(gè)碳上均可能連有2個(gè)氧；通過(guò)HMQC譜可判斷該化合物中碳上所連接的質(zhì)子情況。

分析該化合物的1H-1H COSY譜（圖2）相關(guān)信號(hào)可進(jìn)一步推斷并揭示該分子部分結(jié)構(gòu)片段：H-3與H-2和H-4存在相關(guān)，H-5與H-4和H-6存在相關(guān)，H-6與H-7和H-17存在相關(guān)，H-13與H-12和H-14存在相關(guān)，H-15與H-14和H-16存在相關(guān)，H-20與H-14和H-21存在相關(guān)，H-23與H-24和H-22存在相關(guān)，H-25與H-24和H-26存在相關(guān)，H-26與H-27，以及H-8與H-18，H-10與H-19，H-9與OH-9，H-25與OH-25存在相關(guān)。進(jìn)一步分析HMBC譜（圖2）相關(guān)信號(hào)可揭示半個(gè)分子的結(jié)構(gòu)：H-3與C-1，H-18與C-7和C-9，H-19與C-9和C-11，OH-11與C-10、C-11和C-12以及H-22與C-13和C-26存在相關(guān)。H-7與C-1的關(guān)鍵HMBC相關(guān)信號(hào)證實(shí)了該分子由兩個(gè)上述推斷出的半分子結(jié)構(gòu)通過(guò)1位羧基與7位上的羥基成酯環(huán)合。上述結(jié)構(gòu)片段連接整理即可得到化合物1的平面結(jié)構(gòu)。該化合物的相對(duì)構(gòu)型通過(guò)ROESY實(shí)驗(yàn)（圖3）得到確定：H-2與H-4，H-5與H-3和H-7，H-7與H-17、H-8和OH-9，OH-11與OH-9、H-19和H-13，H-14與H-13和H-15均存在NOE相關(guān)，從而確定了化合物1的相對(duì)構(gòu)型。

依據(jù)HMQC、HMBC 和1H-1H COSY實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將該化合物的1H和13C-NMR數(shù)據(jù)歸屬如下：1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）：δ 6.82（1H，dd，J =15.3，11.3 Hz，H-3），6.11（1H，dd，J=14.9，11.3 Hz，H-4），5.70（1H，d，J=15.3 Hz，H-2），5.65（1H，dd，J=14.9，10.1 Hz，H-5），5.42（s，11-OH），5.09（1H，d，J=10.4 Hz，H-7），4.91（1H，br s，H-22），4.51（d，J=5.9 Hz，24-OH），4.48（d，J=6.9 Hz，

9-OH），4.27（d，J=4.6 Hz，25-OH），3.79（1H，m，overlap，H-13），3.77（1H，m，overlap，H-26），3.75（1H，m，overlap，H-9），3.73（1H，m，overlap，H-15），3.72（1H，m，overlap，H-24），3.38（1H，m，overlap，H-25），2.48（1H，m，H-6），2.27（1H，brd，J=8.4 Hz，H-12a），0.95（1H，m，overlap，H-12b），1.82（1H，m，H-8），1.79（1H，m，H-23a），1.39（1H，m，H-23b），1.59（1H，m，H-20a），1.36（1H，m，H-20b），1.57（1H，m，H-10），1.08（3H，d，J=6.4 Hz，H-27），1.06（1H，m，overlap，H-14），1.05（3H，d，J=6.1 Hz，H-16），0.97（3H，d，J=6.4 Hz，H-17），0.86（3H，d，J=6.9 Hz，H-19），0.79（3H，d，overlap，J=6.8 Hz，H-18），0.79（3H，d，overlap，J=7.7 Hz，H-21）；13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）：δ 167.1 （s，C-1），144.8（d，C-3和C-5），130.6（d，C-4），121.3（d，C-2），99.2（s，C-11），92.5（d，C-22），75.8（d，C-7），70.3（d，C-25），69.4（d，C-9），68.4 （d，C-13），66.4（d，C-15），65.8（d，C-26），64.9（d，C-24），48.0（d，C-14），42.9（d，C-10），41.1（d，C-6），36.6（t，C-12），36.3（d，C-8），32.7（t，C-23），19.2（q，C-16），18.8（t，C-20），17.1（q，C-27），15.5（q，C-17），9.5（q，C-21），8.8（q，C-18），6.9 （q，C-19）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)譜學(xué)數(shù)據(jù)[15]比對(duì)一致，確定化合物1為阿扎霉素（elaiophylin）。該化合物屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，為具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的不飽和十六元環(huán)內(nèi)酯，其化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎，體外抗金黃色葡萄球菌活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其在濃度為25 μg/mL時(shí)抑菌直徑為17 mm，同樣濃度的陽(yáng)性對(duì)照（硫酸鏈霉素）抑菌直徑為23.1 mm。

3 討論與結(jié)論

當(dāng)前廣泛應(yīng)用的抗生素約70%由各種放線菌所產(chǎn)生，而昆蟲(chóng)來(lái)源的放線菌則在天然抗生素分子發(fā)現(xiàn)中未經(jīng)廣泛研究。本研究中，前期對(duì)昆蟲(chóng)金龜子幼蟲(chóng)腸道放線菌Streptomyces sp. BCa1的菌體粗提物進(jìn)行抗金黃色葡萄球菌活性發(fā)現(xiàn)，其具有顯著的抗金黃色葡萄球菌活性，結(jié)果從該粗提物中分離鑒定了其主要活性成分為阿扎霉素B，它是一種具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的不飽和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，均由鏈霉菌產(chǎn)生[16]。此前對(duì)該金龜子幼蟲(chóng)腸道放線菌的發(fā)酵液成分分析發(fā)現(xiàn)其次生代謝產(chǎn)物與Streptomyces hygroscopicus的相同[13]，而且Streptomyces hygroscopicus菌體中也發(fā)現(xiàn)有阿扎霉素B[15，17]，進(jìn)一步從化學(xué)本質(zhì)上證實(shí)金龜子幼蟲(chóng)腸道放線菌Streptomyces sp. BCa1為Streptomyces hygroscopicus。阿扎霉素B具有獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和特有的生物活性，已引起了生物學(xué)家和化學(xué)家的廣泛興趣。本研究中發(fā)現(xiàn)阿扎霉素B對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌-金黃色葡萄球菌具有顯著的抗菌活性，但對(duì)革蘭氏陰性的農(nóng)業(yè)病原細(xì)菌煙草青枯菌，香蕉枯萎病原真菌尖孢鐮刀菌4號(hào)生理小種以及人體病原真菌白色念珠菌等無(wú)抗菌活性。龔雨梅等[17]也發(fā)現(xiàn)阿扎霉素B具有顯著的抗金黃色葡萄球菌活性，而且其結(jié)構(gòu)類似物對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、萬(wàn)古霉素抗性腸球菌等革蘭氏陽(yáng)性致病菌具有顯著的抑菌活性，但對(duì)革蘭氏陰性菌和真菌無(wú)抑制活性[18]。此外阿扎霉素B還具有細(xì)胞毒活性[19]、海蝦幼蟲(chóng)致死活性[20]。更令人感興趣的是它還具有治療家畜線蟲(chóng)感染的作用[16]，但在農(nóng)業(yè)線蟲(chóng)病害上還未見(jiàn)研究。在后續(xù)工作中，將對(duì)該放線菌及其自然或人工突變菌株的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行殺熱帶作物病原線蟲(chóng)活性研究，希望篩選發(fā)現(xiàn)阿扎霉素B及其結(jié)構(gòu)類似物具有殺農(nóng)業(yè)病原線蟲(chóng)活性，進(jìn)而利用該放線菌或其產(chǎn)物用于線蟲(chóng)病害防治。

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