王杰 趙麗霞 雷建都 何靜 郭利群

摘 ?要 ?采用單因素試驗(yàn)，考察乙醇濃度、時(shí)間、溫度、液固比對(duì)枇杷葉中熊果酸提取率的影響。再通過(guò)三因素三水平的響應(yīng)面分析法優(yōu)化枇杷葉中熊果酸的提取工藝，建立二次項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，驗(yàn)證模型的可靠性，并對(duì)熊果酸粗品進(jìn)行純化。結(jié)果表明：最佳提取工藝為乙醇濃度95%，溫度85 ℃，時(shí)間2.8 h，液固比（mL ∶ g）15 ∶ 1。此條件下枇杷葉中熊果酸的提取率為95.4%。熊果酸粗品經(jīng)純化后，純度可達(dá)54.6%。

關(guān)鍵詞 ?枇杷葉;熊果酸;提取;響應(yīng)面分析;純化

中圖分類號(hào) ?R284.2 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Study on Optimization of Extraction Technology of

Ursolic Acid from Eriobotrya japonica Leaves by

Response Surface Method and its Purification

WANG Jie1， ZHAO Lixia1， LEI Jiandu1， HE Jing1 *， GUO Liqun2 *

1 College of Materials Science and Technology， Beijing Forestry University， Beijing 100083， China

2 Yunnan pharmaceutical industry Co.， Ltd， Kunming， Yunnan 650106， China

Abstract ?The optimal extraction technology for the ursolic acid from Eriobotrya japonica leaves is presented in this paper. Firstly， three main factors including ratio of alcohol to water， ratio of liquid to solid， temperature， and extracting time were studied by using single factor analysis method. Then the optimal extraction process was determined by response surface methodology in three factors and three levels， the quadratic mathematical model for extraction was established， and its reliability was verified. Finally the extracted ursolic acid was purified. The optimum extraction technology of ursolic acid is as following： alcohol-water ratio 95%， treatment time 2.8h， temperature 85℃， and liquid-solid ratio 15：1 （mL：g）. Under this condition， the yield and purity of ursolic acid from Eriobotrya japonica leaves was 95.4% and 54.6% respectively.

Key words ?Eriobotrya japonica leaves; Ursolic acid; Extraction; Response surface methodology; Purification

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.026

枇杷[Eriobotrya Japonica（Thunb.）Lindl.]是薔薇科植物，枇杷葉具有止咳化痰、清熱解暑，生津止渴的功效，其對(duì)支氣管炎、肺熱咳嗽等疾病具有良好的療效[1]。熊果酸（ursolic acid，UA），又稱烏蘇酸，屬五環(huán)三萜類化合物，分子式見圖1所示。熊果酸在枇杷葉中含量較高，具有抗氧化[2]、抗肝損傷[3]、抗動(dòng)脈硬化[4]、抗炎[5]、降血脂[6]等功效。熊果酸在皮膚美白、皮炎預(yù)防及治療等方面具有藥物功效。因此，充分開發(fā)利用枇杷葉中熊果酸資源，提高其藥用價(jià)值，具有很大的前景，既有社會(huì)意義又有經(jīng)濟(jì)意義。

目前，傳統(tǒng)溶劑法、超聲輔助提取法、超臨界流體萃取法等是從植物中提取熊果酸的主要常用方法[7]。超聲輔助提取法縮短了提取時(shí)間，加速了萃取過(guò)程，但是受超聲波設(shè)備功率限制，大規(guī)模生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性較低，其安全性也有待驗(yàn)證[8-9];超臨界流體萃取法有效成分提取率較高，產(chǎn)品純度較好，但由于操作壓力大，能耗高，不可連續(xù)化生產(chǎn)，不易于工業(yè)化[10]。溶劑法中的乙醇回流提取整個(gè)工藝使用環(huán)保的溶劑乙醇和水，符合環(huán)境友好化學(xué)的理念，操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)安全，大規(guī)?；a(chǎn)投資較少[11-12]，而且為后續(xù)純化工藝帶來(lái)了便捷。響應(yīng)面法優(yōu)化熊果酸提取工藝在影響因素相同的情況下，實(shí)驗(yàn)數(shù)比中心組合設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)更少，更經(jīng)濟(jì)，可廣泛應(yīng)用于中藥提取、分析檢測(cè)、化學(xué)合成等領(lǐng)域，目前采用本方法提取熊果酸的相關(guān)研究較少。因此，本研究采用響應(yīng)面分析法對(duì)提取枇杷葉中熊果酸的主要工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?實(shí)驗(yàn)材料與儀器

枇杷葉于2014年7月下旬采自廣西桂林，屬于大五星品種，洗凈后真空干燥（50 ℃）、粉碎過(guò)60目篩;熊果酸（圖1）標(biāo)準(zhǔn)品（純度>98%），購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;AB-8大孔吸附樹脂，購(gòu)自安徽三星樹脂科技有限公司;硫酸、氫氧化鈉、乙醇等均為分析純，無(wú)水甲醇為色譜純。

8302型恒溫水浴鍋，余姚金電儀表有限公司;DHG-9036A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司;ATX124型分析天平，日本島津公司;PHS-25精密pH計(jì)，上海雷磁儀器廠;LC3000型高效液相色譜儀，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?色譜條件[13-14] ? Cosmosil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相：無(wú)水甲醇-0.05%磷酸水溶液（88 ∶ 12，V/V）;柱溫：25℃;流速：1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm;進(jìn)樣量：20 μL;靈敏度：0.05AUFS。

1.2.2 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 ? 精確稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品4.5 mg，溶解于含有10 mL無(wú)水乙醇的容量瓶中，制成濃度為0.45 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋得到不同濃度的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行測(cè)定。Y為峰面積，X為質(zhì)量濃度（mg/mL），結(jié)果顯示Y與X線性關(guān)系良好。其峰面積和質(zhì)量濃度呈線性相關(guān)，回歸方程為：Y=2 400 000X+1 787.6，r=0.999 9，r為相關(guān)系數(shù)。

1.2.3 ?熊果酸的提取試驗(yàn) ? （1）單因素試驗(yàn)。稱取適量枇杷葉細(xì)粉，分別在不同的乙醇濃度、溫度、時(shí)間以及液固比條件下回流提取2次，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。合并提取液，過(guò)濾，定容，取上清液，用高效液相色譜儀對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定。

（2）響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)。結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，取自變量為時(shí)間（A）、溫度（B）、液固比（C），響應(yīng)值（Y）為熊果酸提取率，根據(jù)中心組合試驗(yàn)Box-Benhnken設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)方案，見表1，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。使用曲面響應(yīng)法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，確定各因素之間的交互作用對(duì)熊果酸中枇杷葉提取率的影響，優(yōu)化工藝條件。

1.2.4 ?純化 ? （1）酸堿純化法。按照相關(guān)文獻(xiàn)[15]進(jìn)行酸堿純化處理，重復(fù)3次取平均值，采用高效液相色譜儀測(cè)定熊果酸的純度。

（2）大孔吸附法。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[16]，選取比表面積較大的AB-8大孔吸附樹脂，考察靜態(tài)吸附時(shí)間與熊果酸吸附量的關(guān)系，重復(fù)3次取平均值。采用高效液相色譜儀測(cè)定熊果酸的純度。熊果酸吸附量qe計(jì)算公式如下：

qe=（C0-Ce）×V/W

其中：C0為吸附前溶液中熊果酸濃度（mg/mL）;Ce為吸附后溶液中熊果酸濃度（mg/mL）;V為溶液的體積（mL）;W為大孔吸附樹脂吸附劑質(zhì)量（g）;

1.2.5 ?原料中熊果酸含量計(jì)算 ? 稱取適量枇杷葉細(xì)粉，用95%乙醇溶液在圓底燒瓶中回流提取多次，直至高效液相色譜無(wú)法檢測(cè)出熊果酸。將所有提取液合并濃縮，定容至100 mL，采用高效液相色譜儀測(cè)定原料中熊果酸含量，試驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值。

C=100×a×10-3/m

式中，C為枇杷葉中熊果酸含量（g/g），a為所測(cè)濃度（mg/mL），m為枇杷葉的質(zhì)量（g）。

1.2.6 ?提取率計(jì)算 ? Y=C1/C2×100%，其中，Y為熊果酸提取率，C1為每次提取液經(jīng)過(guò)高效液相色譜儀測(cè)定所得（g/g），C2為“1.2.5”式中所測(cè)得（g/g）。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 ?乙醇濃度對(duì)提取率的影響 ? 提取溫度為85℃，提取時(shí)間為3 h，液固比（mL ∶ g）為10 ∶ 1時(shí)，乙醇濃度對(duì)提取率的影響見圖2所示。由圖2可知：乙醇濃度在70%～100%范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的增加，熊果酸的提取率也升高;當(dāng)乙醇濃度超過(guò)90%，提取率顯著升高;當(dāng)乙醇濃度大于95%，熊果酸提取率增加不明顯，趨于穩(wěn)定。由于熊果酸屬于五環(huán)三萜類化合物，極性較弱，根據(jù)相似相容原理，乙醇濃度在95%時(shí)，其極性與熊果酸相近，此時(shí)熊果酸在溶劑中溶解度達(dá)到最大，提取率顯著升高。

2.1.2 ?溫度對(duì)提取率的影響 ? 溫度與傳質(zhì)速率呈正相關(guān)，所以傳質(zhì)速率隨著溫度升高而增大，同時(shí)，溫度升高使得溶劑黏度和傳質(zhì)阻力減小，促進(jìn)傳質(zhì)速率增大[17]。而溫度過(guò)高，則會(huì)破壞熊果酸的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，而且增加工業(yè)能耗，所以溫度的選擇很關(guān)鍵。

乙醇濃度為95%，提取時(shí)間為3 h，液固比（mL ∶ g）為10 ∶ 1時(shí)，溫度對(duì)提取率的影響見圖3所示。圖3表明，70～95 ℃范圍內(nèi)回流提取，起初熊果酸的提取率隨溫度升高顯著增加，達(dá)到85 ℃后，提取率緩慢增加到趨于穩(wěn)定。由于隨著溫度升高，分子熱運(yùn)動(dòng)增加，傳質(zhì)速率增大，而溫度達(dá)到85 ℃，提取傳質(zhì)速率增加緩慢，熊果酸的提取率趨于穩(wěn)定;若溫度過(guò)高，會(huì)破壞熊果酸的分子結(jié)構(gòu)，影響提取率。

2.1.3 ?提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 ? 乙醇濃度為95%，溫度為85 ℃，液固比（mL ： g）為10 ： 1時(shí)，提取時(shí)間對(duì)提取率的影響見圖4。圖4表明：0.5～3 h范圍內(nèi)，起初熊果酸提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到2.5 h后提取率趨于穩(wěn)定。因?yàn)樵谔崛〕跗?，溶劑不斷向枇杷葉內(nèi)部擴(kuò)散，溶解熊果酸，后期向溶劑主體擴(kuò)散，直到兩者濃度接近相同，最終擴(kuò)散過(guò)程處于動(dòng)態(tài)平衡。

2.1.4 ?液固比對(duì)提取率的影響 ? 乙醇濃度為95%，溫度為85 ℃，提取時(shí)間為3 h時(shí)，液固比對(duì)提取率的影響見圖5。圖5表明，液固比（mL ： g）在5 ： 1～25 ： 1范圍內(nèi)，當(dāng)液固比（mL ： g）小于10 ： 1，枇杷葉中熊果酸的提取率隨液固比的增大而顯著提高，這是因?yàn)槿軇┑脑黾蛹涌炝巳苜|(zhì)的傳質(zhì)速率，使得提取率顯著提高。但當(dāng)液固比（mL ： g）大于10 ： 1，熊果酸提取率提高緩慢。原料一定時(shí)，若溶劑用量太大，則工業(yè)化生產(chǎn)的成本升高，考慮到熊果酸提取率和生產(chǎn)效益，選擇液固比（mL ： g）為10 ： 1較為合適。

2.2 ?響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 ?響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果 ? 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2所示。

2.2.2 ?模型的建立及其顯著性檢驗(yàn) ? 通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中熊果酸提取率進(jìn)行處理，得回歸方程：Y=0.88+2.500E-003A+0.081B+0.066C-0.012AB+0.073AC+1.000E-002BC-0.047A2-0.13B2-0.059C2

由表3知，回歸方程F值為10.12，相關(guān)系數(shù)R2=0.948 0，p<0.05，說(shuō)明回歸方程擬合較好，本試驗(yàn)可信性和準(zhǔn)確性高;失擬項(xiàng)（p值為0.066 6）不顯著說(shuō)明試驗(yàn)誤差很小。

2.2.3 ?響應(yīng)面法對(duì)提取工藝的分析與優(yōu)化 ? 根據(jù)以上回歸模型，可以擬合出相應(yīng)的三維球面圖與二維等高曲線圖（圖6～8），通過(guò)三維圖與曲線圖，可看出試驗(yàn)水平與每個(gè)變量或變量之間交互影響的響應(yīng)值之間的關(guān)系。根據(jù)等高線的形狀可以判斷變量之間交互影響的顯著性。圓形等高線表明兩變量之間的交互影響不顯著;橢圓形等高線表明兩變量之間的交互影響顯著[18-19]。

圖6表明，提取時(shí)間一定時(shí)，在75～90 ℃范圍內(nèi)，熊果酸的提取率隨著提取時(shí)間的增加而明顯升高;在90 ℃左右出現(xiàn)極值;之后繼續(xù)提高溫度，提取率下降。沿溫度方向的等高線密度變化相對(duì)時(shí)間方向高，說(shuō)明溫度對(duì)熊果酸提取率的影響大于時(shí)間的影響。

圖7表明，當(dāng)液固比（mL ： g）大于10 ： 1，時(shí)間在1～3 h范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的增加熊果酸提取率升高，且在1～2.5 h內(nèi)熊果酸提取率升高顯著。

圖8表明，同一液固比下，在75～95 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，熊果酸提取率升高;在90 ℃左右，提取率達(dá)到極值。且在75～90 ℃范圍內(nèi)熊果酸提取率升高顯著。等高線密度沿溫度方向變化較大，說(shuō)明溫度對(duì)提取率的影響大于液固比的影響。

2.2.4 ?較優(yōu)提取條件驗(yàn)證 ? 為驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性，在優(yōu)化條件下提取枇杷葉熊果酸，考慮到實(shí)際操作，將工藝參數(shù)修正為：提取時(shí)間2.8 h，溫度85 ℃，液固比（mL ： g）15 ： 1。在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，平均提取率為95.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%，熊果酸提取量為8.78 g/kg，表明提取實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和精密度較好。模型預(yù)測(cè)的最大提取率為93.3%，比驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的平均提取率95.4%低2.1%，表明模型預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間擬合良好，驗(yàn)證了模型的有效性。

2.3 ?熊果酸的純化

從圖9可以看出，當(dāng)吸附時(shí)間在0～150 min內(nèi)，熊果酸吸附量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，90 min時(shí)吸附基本飽和，此后逐漸趨于平穩(wěn)。AB-8樹脂對(duì)熊果酸的吸附速率隨時(shí)間而變化，0～50 min內(nèi)吸附速率較快，50 min以后吸附速率減緩，90 min以后吸附飽和，為了節(jié)約時(shí)間和生產(chǎn)成本，選擇吸附時(shí)間為90 min。熊果酸吸附量與吸附時(shí)間的關(guān)系擬合為：y=-0.000 8x2+0.192 2x+1.586 7，R2=0.976 2，y為熊果酸吸附量（mg/g），x為吸附時(shí)間（min）。

通過(guò)乙醇對(duì)枇杷葉中熊果酸進(jìn)行提取，選擇酸堿處理法和AB-8大孔吸附樹脂對(duì)粗提物進(jìn)行純化。從圖10可以看出，未處理的熊果酸純度為7.4%，酸堿處理法純化后熊果酸純度為32.3%，酸堿處理及AB-8吸附樹脂純化后熊果酸純度為54.6%。與已有的報(bào)道相比[20]，純化效果較好。

熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品、枇杷葉提取液、純化后熊果酸高效液相色譜圖分別見圖11～13，通過(guò)對(duì)比可以看出，經(jīng)過(guò)酸堿沉淀處理和AB-8大孔吸附樹脂純化后，熊果酸HPLC圖譜雜峰減少，純度增加。

3 ?討論與結(jié)論

本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法得到了提取枇杷葉中熊果酸的較優(yōu)條件，利用Design Expert軟件優(yōu)化了枇杷葉中熊果酸的提取工藝，并建立二次多項(xiàng)式回歸模型，通過(guò)方差分析、響應(yīng)面分析和驗(yàn)證試驗(yàn)表明該模型可靠，可以較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)熊果酸的實(shí)際提取率。

由響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取枇杷葉中熊果酸的3個(gè)因素：溫度、提取時(shí)間、液固比，得出其主次關(guān)系為：提取時(shí)間>液固比>溫度，結(jié)合單因素試驗(yàn)，優(yōu)化提取條件為：乙醇濃度95%，溫度85 ℃，提取時(shí)間2.8 h，液固比（mL ∶ g）15 ∶ 1，此條件下熊果酸提取率可達(dá)93.3%，熊果酸提取量為8.78 g/kg，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的平均提取率為95.4%，預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值間擬合良好，證實(shí)了模型的有效性。超聲波輔助法和亞臨界水法提取枇杷葉中熊果酸的提取時(shí)間少于回流提取法，但是提取率均較低[21-22]。響應(yīng)面法優(yōu)化后的乙醇提取工藝使得熊果酸的平均提取率達(dá)到95%以上。在熊果酸的純化過(guò)程中，酸堿純化法去除了雜質(zhì)中的葉綠素及大極性物質(zhì)，大孔吸附樹脂法除去了的多酚、黃酮等雜質(zhì)，兩者結(jié)合使用，操作簡(jiǎn)單易行，純化效果較好，熊果酸純度可達(dá)54.6%，該研究為熊果酸的工業(yè)化提取純化提供了高效綠色途徑。

參考文獻(xiàn)

[1] Choi Y G， Seok Y H， Yeo S， et al. Protective changes of inflammation-related gene expression by the leaves of Eriobotrya japonica in the LPS-stimulated human gingival fibroblast： microarray analysis[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2011， 135（3）： 636-645.

[2] Ramachandran S， Prasad N R. Effect of ursolic acid， a triterpenoid antioxidant， on ultraviolet-B radiation-induced cytotoxicity， lipid peroxidation and DNA damage in human lymphocytes[J]. Chemico-biological Interactions， 2008， 176（2）： 99-107.

[3] 張明發(fā)， 沈雅琴. 齊墩果酸和熊果酸保肝藥理作用的研究進(jìn)展[J]. 抗感染藥學(xué)， 2012， 9（1）： 13-19.

[4] Ullevig S L， Zhao Q， Zamora D， et al. Ursolic acid protects diabetic mice against monocyte dysfunction and accelerated atherosclerosis[J]. Atherosclerosis， 2011， 219（2）： 409-416.

[5] Yunoki K， Sasaki G， Tokuji Y， et al. Effect of dietary wine pomace extract and oleanolic acid on plasma lipids in rats fed high-fat diet and its DNA microarray analysis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2008， 56（24）： 12 052-12 058.

[6] Kim J， Jang D S， Kim H， et al. Anti-lipase and lipolytic activities of ursolic acid isolated from the roots of Actinidia arguta[J]. Archives of Pharmacal Research， 2009， 32（7）： 983-987.

[7] 文小靜， 張永利. 熊果酸的提取工藝研究[J]. 實(shí)用藥物與臨床， 2006， 9（6）： 342-343.

[8] 于明明， 周富強(qiáng)， 劉軍海. 熊果酸提取工藝的研究進(jìn)展[J]. 氨基酸和生物資源， 2009， 31（1）： 33-36.

[9] Vetal M D， Lade V G， Rathod V K. Extraction of ursolic acid from Ocimum sanctum by ultrasound： process intensification and kinetic studies[J]. Chemical Engineering and Processing： Process Intensification， 2013， 69： 24-30.

[10] 李宏楊， 劉 ?飛， 張鳳琴， 等. 超臨界CO2萃取技術(shù)分離和純化苦丁茶中熊果酸的工藝[J]. 熱帶生物學(xué)報(bào)， 2012， 3（3）： 258-260.

[11] 劉柯彤， 陶亮亮， 馬 ?雄， 等. 熊果酸的生物活性及其提取工藝的研究進(jìn)展[J]. 化工技術(shù)與開發(fā)， 2010（8）： 41-44.

[12] 危 ?晴， 楊國(guó)偉， 王曉杰， 等. 鎖陽(yáng)中熊果酸的索氏提取工藝優(yōu)化[J]. 食品研究與開發(fā)， 2013， 34（7）： 85-88.

[13] 張汶婕， 管大平， 錢世兵. HPLC測(cè)定左歸丸中齊墩果酸與熊果酸含量[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2012， 18（5）： 92-94.

[14] 李 ?科， 吾魯木汗·那孜爾別克， 喬 ?杰， 等. HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地白花泡桐中熊果酸和木犀草素的含量[J]. 藥物生物技術(shù)， 2011， 18（3）： 251-255.

[15] 李 ?陽(yáng)， 陳旅翼， 余曉暉， 等. 酸堿處理法純化白花泡桐葉中熊果酸的工藝研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 41（8）： 3 371-3 373.

[16] 林國(guó)榮， 郭養(yǎng)浩. 枇杷葉中熊果酸和科羅索酸分離工藝優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技， 2014， 35（24）： 304-307.

[17] 劉國(guó)平， 趙立杰， 馮 ?怡， 等. 中藥制劑原料吸濕動(dòng)力學(xué)初步探討[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2014， 20（6）： 15-19..

[18] Wei L， Zhang W， Yin L， et al. Extraction optimization of total triterpenoids from Jatropha curcas leaves using response surface methodology and evaluations of their antimicrobial and antioxidant capacities[J]. Electronic Journal of Biotechnology， 2015， 18（2）： 88-95.

[19] Yan M A， Jin W， Pengzhou X I， et al. Optimization of extraction technology of ursolic acid from sambucus chinensis by response surface method[J]. Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica， 2012， 21（6）： 156-161.

[20] Yu J， Zeng M， He Z， et al. Study on optimization for the extraction of ursolic acid from loquat leaf[J]. Science and Technology of Food Industry， 2013， 13： 41.

[21] Verma S C， Jain C L， Kumari A， et al. Microwave‐assisted extraction and rapid isolation of ursolic acid from the leaves of Eucalyptus× hybrida Maiden and its quantification using HPLC‐diode array technique[J]. Journal of Separation Science， 2013， 36（7）： 1 255-1 262.

[22] 于金召， 曾茂茂， 何志勇， 等. 亞臨界水提取枇杷葉中熊果酸的工藝優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技， 2013， 34（13）： 189-192.