王琴飛 李莉萍 高玲 王明 應(yīng)東山 張如蓮

摘 ?要 ?采用Waters Atlantis C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以2%甲醇-98% 0.01 mol/L K2HPO4溶液（用H3PO4調(diào)節(jié)pH2.8）作為流動(dòng)相，流速為0.6 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，檢測波長為210 nm，建立高效液相色譜同時(shí)分析西番蓮中10種有機(jī)酸的方法。結(jié)果表明：該方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.22%～4.00%，平均回收率在88.0%～109.6%，各種酸的線性相關(guān)系數(shù)r>0.999 2，檢測限為0.001～0.22 μg/mL;采用外標(biāo)法定量。在紫果和黃果西番蓮中檢測到7種有機(jī)酸，其含量趨勢呈現(xiàn)為檸檬酸>L-蘋果酸>L-乳酸>琥珀酸>L-抗壞血酸>酒石酸>富馬酸。該方法具有靈敏度高、測試組分多、速度快等優(yōu)點(diǎn)，適用于西番蓮中多種有機(jī)酸的測定。

關(guān)鍵詞 ?反相高效液相色譜法;西番蓮;有機(jī)酸

中圖分類號 ?TS255.7 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ?A

Analysis of Organic Acids in Passion Fruit by Reverse

Phase High Performance Liquid Chromatography

WANG Qinfei， LI Liping， GAO Ling， WANG Ming， YING Dongshan， ZHANG Rulian*

Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of

Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China/Ministry of Agriculture Quality

Control and Test Centre for Seeds/Seedlings of Tropical Crops， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract ?A method for simultaneous determination of ten organic acids in passion fruit pulp by reverse phase high performance liquid chromatography was established. Waters Atlantis C18 column（150 mm×4.6 mm， 5 μm）was used at 30 ℃ and mobile phase was 2% CH3OH-0.01 mol/L K2HPO4（pH2.8）with flow rate of 0.6 mL/min. Detection wavelength was at 210 nm. The quantifidation was carried out by external stsndardization method. The relative standard deviations were 0.22%-4.00% and the average recoveries were 88.0%-109.6%. The correlation coefficients for the linear equations were above 0.999 2. and the detection limits were 0.001-0.22 μg/mL. The results indicated that the method was simple， rapid and accurate. The method was applied to the determination of organic acids in passion fruit. Seven organic acids were detected in P. edulis Sims and P. edulis f. flauicarpa Degener， and the trends of organic acids contents were present in citric acid>malic acid>lactic acid>succinic acid>ascorbic acid>tartaric acid>fumaric acid in passion fruit.

Key words ?Reversed phase high performance liquid chromatography;passion fruit;Organic acid

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.025

西番蓮（Passiflora edulis）俗稱雞蛋果，由于有濃郁而特殊的香味，也稱為“百香果”，屬西番蓮科西番蓮屬，熱帶多年生草質(zhì)至半木質(zhì)藤本攀附果樹，原產(chǎn)于澳大利亞和南美洲的巴西，現(xiàn)廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。中國臺(tái)灣、廣東、廣西、云南、海南等地種植西番蓮已有很長的歷史，并形成了一定的規(guī)模。西番蓮成熟后果汁含量占果肉的80%以上，維生素含量70 mg/100 g，其酸度pH值在2.7～3.1[1]，有機(jī)酸含量可達(dá)4.0%，西番蓮果汁的含酸量很高，糖酸比低，介于4.14 ∶ 1～1.66 ∶ 1，與人群口味認(rèn)可的13 ∶ 1～15 ∶ 1相差甚遠(yuǎn)，原果汁無法直接飲用，需要加水稀釋成果汁飲料或與其他低酸性果汁調(diào)配成混合果汁[2]。因此，西番蓮除少量鮮食外，大部分都用于生產(chǎn)復(fù)合果汁、果醬和酸奶[3-5]。而有機(jī)酸是果汁酸味的主要成分，其種類和含量高低與果汁或果肉的品質(zhì)和風(fēng)味有極密切的關(guān)系，并且可通過測定各種有機(jī)酸的含量來鑒別果汁飲料摻假與否[6-7]。測定果品有機(jī)酸的方法很多，有氣相色譜法[8]、離子色譜法[9-11]、高效液相色譜法等[1， 6， 12-14]。高效液相色譜法前處理比較簡單，具有準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)測定樣品中多種有機(jī)酸，目前應(yīng)用最為廣泛。研究者常以檸檬酸和蘋果酸作為西番蓮酸味的代表性酸[4， 15]，而西番蓮中有機(jī)酸種類和多種有機(jī)酸的液相色譜檢測方法還未見報(bào)道。本研究擬建立一種高效液相色譜方法同時(shí)測定西番蓮中10種有機(jī)酸，為分析西番蓮果汁中有機(jī)酸的種類提供檢測依據(jù)，同時(shí)也為西番蓮果汁加工產(chǎn)業(yè)提供理論參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

紫果西番蓮（Passiflora edulis Sims）和黃果西番蓮（P. edulis f. flauicarpa Degener）夏季采摘于農(nóng)業(yè)部植物新品種測試分中心（儋州）西番蓮種質(zhì)資源圃。于黃果果皮呈黃色、紫果果皮紫色面積大于整果的2/3時(shí)采摘。采摘健康、果型完整的果實(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室后，立即取出果肉，用密封袋保存于-40 ℃冰箱內(nèi)待用。

標(biāo)準(zhǔn)樣品草酸（oxilic acid）、酒石酸（tartaric acid）、奎寧酸（quinic acid）、L-蘋果酸（malic acid）、L-抗壞血酸（ascorbic acid）、L-乳酸（lactic acid）、乙酸（acetic acid）、檸檬酸（citric acid）、富馬酸（fumaric acid）、琥珀酸（succinic acid）、甲醇（色譜純）購買于美國Sigma公司，磷酸、磷酸氫二鉀為分析純。

采用Aglent1260型液相色譜系統(tǒng)分析上述10種有機(jī)酸，配備自動(dòng)進(jìn)樣器（型號：G1329B）、二極管陣列列檢測器（型號：G1315D）和柱溫箱（型號：G1316A）。色譜柱為Atlantis C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），購買于美國Waters公司;超純水由Elix3+Synergy超純水系統(tǒng)制備，購買于美國Millipore公司;超聲波清洗器（KQ-400KDE）購買于江蘇昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?西番蓮有機(jī)酸的提取 ? 稱取冰凍的西番蓮果肉5.00 g放入研缽中，加入10 mL 0.01 mol/L的K2HPO4溶液（pH2.8），冰上研磨使果肉與種子完全分離，將研磨后的樣品緩慢倒入50 mL容量瓶，用0.01 mol/L的K2HPO4溶液沖洗研缽3次，并定容至50 mL，放入超聲波清洗器中超聲提取30 min（超聲頻率為320 kHz，溫度為30 ℃），過濾后取濾液離心（10 000×g，20 min），上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后直接進(jìn)樣。每個(gè)樣品做3次重復(fù)。

1.2.2 ?有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 ? 分別稱取適量的標(biāo)準(zhǔn)樣品L-蘋果酸、檸檬酸，用超純水定容至25 mL，配置成質(zhì)量濃度為20 mg/mL單標(biāo)母液;草酸、酒石酸、奎寧酸、L-抗壞血酸、L-乳酸、乙酸、富馬酸、琥珀酸配置成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的單標(biāo)母液，于4 ℃冰箱保存。使用時(shí)，將其依次稀釋配置成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后使用。

1.2.3 ?色譜條件 ? Waters Atlantis C18色譜柱（150 mm×4.6 mm， 5 μm），流動(dòng)相為2%甲醇-98% 0.01 mol/L K2HPO4溶液（用H3PO4調(diào)節(jié)pH2.8），流速為0.6 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，檢測波長為210 nm。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?檢測波長的確定

通過紫外波長190～300 nm對10種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描，結(jié)果表明，9種有機(jī)酸在210 nm附近有最大吸收峰，只有L-抗壞血酸在240 nm下有最大吸收峰，考慮到多種有機(jī)酸一次性檢測，因此，在210 nm波長下進(jìn)行檢測。

2.2 ?流動(dòng)相種類的選擇

采用高效液相色譜法測定果品中有機(jī)酸的報(bào)道很多，但使用的流動(dòng)相種類和pH都不相同，常用的流動(dòng)相有NaH2PO4、KH2PO4、K2HPO4等[6， 16-18]，pH根據(jù)色譜柱的不同從2.1變化到2.9，通過比較不同的流動(dòng)相種類（pH2.5，柱溫30 ℃，流速0.5 mL/min），得到10種有機(jī)酸的保留時(shí)間（圖1），雖然在保留時(shí)間差異不大，但在使用0.01 mol/L的NaH2PO4、KH2PO4分析這10種有機(jī)酸時(shí)，酒石酸和奎寧酸、抗壞血酸和乳酸都不能完全分離，而K2HPO4更適合該色譜柱的流動(dòng)相分離這10種有機(jī)酸，10種有機(jī)酸能得到有效分離。因高濃度的鹽對色譜柱的壽命有影響，因此本實(shí)驗(yàn)采用0.01 mol/L的K2HPO4作為流動(dòng)相。

2.3 ?流動(dòng)相pH的選擇

以2.2中0.01 mol/L K2HPO4作為流動(dòng)相，以H3PO4調(diào)節(jié)不同的pH值，測定10種有機(jī)酸的保留時(shí)間。結(jié)果表明，流動(dòng)相pH值對有機(jī)酸保留時(shí)間影響較大（圖2）。當(dāng)pH為2.2～2.4時(shí)，酒石酸和奎寧酸完全不能分離，隨著pH的增大，分離效果越好;但pH為2.6～2.7時(shí)，富馬酸和琥珀酸不能分離;在pH2.8時(shí)，這2種有機(jī)酸的出峰順序發(fā)生改變;而在pH達(dá)到3.0時(shí)，乙酸和檸檬酸不能基線分離，因此，選擇pH2.8的0.01 mol/L K2HPO4作為流動(dòng)相篩選后續(xù)的因子。

2.4 ?流動(dòng)相中甲醇含量的選擇

流動(dòng)相中加入少量甲醇，可改善有機(jī)酸的峰形，但高比例的甲醇會(huì)使得柱壓升高，檸檬酸和乙酸也完全不能分離[6]。因此，在2.3的優(yōu)化條件下，比較了0～4%甲醇比例下10種有機(jī)酸的分離效果（圖3）。結(jié)果表明，隨著甲醇比例的增加，出峰時(shí)間縮短;甲醇比例為0時(shí)，各種有機(jī)酸拖尾嚴(yán)重，L-抗壞血酸和L-乳酸的分離度也低;但當(dāng)甲醇比例達(dá)到4%時(shí)，酒石酸和奎寧酸的出峰時(shí)間重合，L-蘋果酸和L-抗壞血酸分離度降低。雖然甲醇比例為1%時(shí)分離效果好，但分離時(shí)間較長，樣品中雜質(zhì)對L-抗壞血酸和L-乳酸的分離度干擾較大，綜合考慮分離時(shí)間和分離效果，2%的甲醇比例更為合適。因此，選擇出峰時(shí)間較短、峰形較好、甲醇比例為2%進(jìn)行后續(xù)單因素實(shí)驗(yàn)。

2.5 ?色譜柱溫度的選擇

在2.4較優(yōu)色譜條件下，考察了不同的柱溫對10種有機(jī)酸的分離情況（圖4），結(jié)果表明，柱溫的增加可縮短分析時(shí)間，對有機(jī)酸的出峰順序沒有影響。柱溫過低，酒石酸和奎寧酸分離度不好;而柱溫過高，乙酸和檸檬酸的分離度降低。L-抗壞血酸和L-乳酸的分離度隨柱溫的增加而變大。在柱溫為30 ℃時(shí)，10種有機(jī)酸能在10 min左右分析完成，因此，可選擇分離較好的30 ℃柱溫進(jìn)行后續(xù)因子的篩選實(shí)驗(yàn)。

2.6 ?其它條件的選擇

以2%CH3OH-K2HPO4（pH2.8）溶液作為流動(dòng)相，在柱溫30 ℃條件下，比較了流速0.2～1 mL/min對保留時(shí)間的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著流速的升高，10種有機(jī)酸的分離時(shí)間減少;流速為0.2 mL/min時(shí)，10種有機(jī)酸需要25 min才能全部出峰;而流速過快，10種有機(jī)酸的分離度也降低，柱壓升高，不利于色譜柱的保護(hù)和長期使用。因此，以柱壓較低，分離度較好，出峰時(shí)間在10 min左右完成10種有機(jī)酸分離的0.6 mL/min流速進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。。

2.7 ?分離條件的優(yōu)化

綜合以上單因素條件優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)，以盧佩章提出的串行色譜響應(yīng)函數(shù)HCRF[19]，對單因素分離條件進(jìn)行比較，最終得到優(yōu)化的條件：（1）流動(dòng)相為2%CH3OH-0.01 mol/L K2HPO4（pH2.8）;（2）流速為0.6 mL/min; （3）柱溫為30 ℃。圖5為該條件下測定的10種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品和西番蓮樣品的色譜圖和加標(biāo)樣品圖，10種有機(jī)酸在11 min內(nèi)均得到有效分離。

2.8 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、精密度及回收率

在上述得到的最優(yōu)條件下，將有機(jī)酸單標(biāo)母液稀釋成5個(gè)濃度梯度的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣10 μL，以峰面積y對質(zhì)量濃度（x，μg/mL）作圖，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（表1），并對結(jié)果進(jìn)行回歸分析，由表1可知，各有機(jī)酸的相關(guān)系數(shù)在0.999 2～1.0范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。再以3倍信噪比（S/N）時(shí)，各有機(jī)酸的濃度作為最小檢測限（表1）。

取紫果西番蓮樣品5份，采用1.2.1的方法提取有機(jī)酸，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上樣，用于考察方法的精密度（表1），10種有機(jī)酸的RSD在0.22%～4.00%。另取同一樣品4份，1份作為本底，參照王冉等[20]的方法，另外3份樣品分別按紫果西番蓮樣品有機(jī)酸總量的80%、100%、120%加入有機(jī)酸混合標(biāo)樣，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，如表1所示，得到各有機(jī)酸的平均回收率在88.0%～109.6%。表明該方法準(zhǔn)確靈敏、重現(xiàn)性好、回收率高。

2.9 ?西番蓮樣品中有機(jī)酸定量分析

用優(yōu)化的色譜條件，分析了紫果和黃果西番蓮果肉中有機(jī)酸的含量和種類，結(jié)果見表2，紫果和黃果西番蓮中有7種相同的有機(jī)酸，而草酸、奎寧酸和乙酸都未檢測到;7種有機(jī)酸含量以檸檬酸最高，紫果和黃果西番蓮的含量分別達(dá)到了14.8、19.1 mg/g，富馬酸含量最低。紫果西番蓮中酒石酸和L-抗壞血酸含量高于黃果西番蓮，2種西番蓮中L-蘋果酸含量基本相同，其他5種有機(jī)酸含量都是黃果西番蓮較高。7種有機(jī)酸的含量趨勢呈現(xiàn)為檸檬酸>L-蘋果酸>L-乳酸>琥珀酸>L-抗壞血酸>酒石酸>富馬酸。

3 ?討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)比較了10%乙醇和流動(dòng)相常溫超聲提取2種方法提取西番蓮果肉中的有機(jī)酸[9]，雖然超聲提取過程中L-抗壞血酸的含量有所下降，但樣品中檸檬酸的含量卻明顯增加，7種有機(jī)酸總量也達(dá)到最大值;但2種提取方法中7種有機(jī)酸總含量差異不顯著（數(shù)據(jù)未發(fā)表），因此選擇以流動(dòng)相直接提取的方法更方便快捷，采用超聲提取的方法以提高提取效率[21-22]。同時(shí)，選擇了冰上研磨勻漿，防止抗壞血酸的進(jìn)一步降解。

有機(jī)酸是果實(shí)風(fēng)味的重要組成部分，多數(shù)鮮果以蘋果酸和檸檬酸為代表[9]，但也有很多水果有其特殊的有機(jī)酸，如楊梅果實(shí)中琥珀酸的含量最高[16];葡萄果實(shí)中酒石酸含量僅次于蘋果酸[23]。果品中有機(jī)酸種類的不同，因此賦予了不同果品味道的差異[14， 24]。紫果和黃果西番蓮中有機(jī)酸種類相同，但各種有機(jī)酸含量都有所差異，這可能是品種的差異所致，2種西番蓮中有機(jī)酸都以爽快可口的檸檬酸和L-蘋果酸為主要的酸味物質(zhì)，與菠蘿的酸味特點(diǎn)相似[25];同時(shí)，西番蓮果肉中存在大量的乳酸，含量僅次于L-蘋果酸，該有機(jī)酸是發(fā)酵食品中的代表性酸，酸味柔和[26]，而很多果品中該酸不存在或含量較低，這使得西番蓮果汁成為酸奶制品的添加成分成為可能。在樣品中還檢測到高含量的琥珀酸，該酸常作為評價(jià)葡萄酒口感的一個(gè)特征酸，能賦予產(chǎn)品鮮美的味道[27]。同時(shí)，在西番蓮果肉中還檢測了較高含量的L-抗壞血酸，其含量僅次于鮮榨的橙汁[6]。而樣品中沒有檢測到口感為發(fā)澀或苦味的草酸、奎寧酸和較強(qiáng)刺激味的乙酸[20， 26]。結(jié)果證明，紫果和黃果西番蓮中有機(jī)酸種類豐富，味道獨(dú)特，可作為“天然的濃縮果汁”，在果汁和果醬加工中應(yīng)用。但西番蓮收獲期可從一年的7月中下旬持續(xù)到12月底，不同的采收時(shí)期和貯藏過程中果汁品質(zhì)差異大，有機(jī)酸及其糖分的變化也較大[2]，因此，不同采收時(shí)期和貯藏方式有機(jī)酸種類和含量變化有待進(jìn)一步研究探索，才能在西番蓮復(fù)合果汁等產(chǎn)品加工中提供準(zhǔn)確的參考依據(jù)。

本研究采用Waters Atlantis C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以2%甲醇-98% 0.01 mol/L K2HPO4溶液（用H3PO4調(diào)節(jié)pH2.8）作為流動(dòng)相，流速為0.6 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，檢測波長為210 nm，分析了紫果和黃果西番蓮中10種有機(jī)酸。該方法具有靈敏度高、測試組分多、速度快等優(yōu)點(diǎn)，適用于西番蓮中多種有機(jī)酸的測定。

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