陳燊 曾紅亮 陳萬明 張怡

摘 ?要 ?為了研究超聲微波協(xié)同提取橄欖多糖及其脫蛋白工藝，通過考察超聲波功率、微波功率和提取時(shí)間等3個(gè)單因素對多糖得率影響的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對超聲微波協(xié)同提取橄欖多糖的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并采用酶法對橄欖粗多糖脫蛋白工藝進(jìn)行研究。結(jié)果表明，超聲微波協(xié)同提取橄欖多糖的最佳工藝條件為：超聲波功率為250 W、微波功率為150 W和提取時(shí)間為15 min，在此條件下，橄欖多糖的得率為（10.6±0.3）%;橄欖多糖酶法脫蛋白的最佳工藝條件為：酶解溫度為40 ℃、酶解時(shí)間為70 min和酶添加量為70 U/g，在此條件下，橄欖多糖脫蛋白率為（77.0±2.5）%。超聲微波協(xié)同提取法是一種快速有效的提取橄欖多糖的方法。

關(guān)鍵詞 ?橄欖;多糖;超聲微波協(xié)同提取;脫蛋白

中圖分類號 ?TS201.1 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ?A

Technology of Ultrasonic/Microwave Assisted Extraction

and Deproteinization of Polysaccharides from

Canarium album（Lour.）Raeusch

CHEN Shen，ZENG Hongliang，CHEN Wanming，ZHANG Yi*

College of Food Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract ?Ultrasonic/microwave assisted extraction（UMAE） and deproteinization of polysaccharides from Canarium album（Lour.）Raeusch （CPS） were studied. The effects of ultrasonic power， microwave power and extraction time on the yield of CPS were investigated， respectively. Based on single factor experiments， the extraction technology of CPS extracted by UMAE was optimized by the orthogonal test. Moreover， the technology of deproteinization of crude CPS was studied using papain. The results showed that the optimum extraction conditions were as follows： ultrasonic power of 250 W， microwave power of 150 W and extraction time of 15 min. Under these conditions， the yield of polysaccharides could be up to （10.6±0.3）%. The optimum conditions of deproteinization were as follows： temperature of 40 ℃， time of 70 min and content of enzyme of 70 U/g. Under the above conditions，the rate of deproteinization could reach to （77.0±2.5）%. UMAE was an attractive method for extracting CPS with fast speed and high efficiency.

Key words ? Canarium album（Lour.）Raeusch;Polysaccharides;Ultrasonic/microwave assisted extraction;Deproteinization

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.021

橄欖[Canarium album（Lour.）Raeusch]又名青果、福果，是橄欖科橄欖屬植物的果實(shí)，是熱帶、亞熱帶的名優(yōu)水果之一[1]。橄欖原產(chǎn)于中國東南地區(qū)，主要分布在福建、廣東、臺灣、四川、云南、浙江等省[2]。福建省閩侯縣被稱為“中國橄欖之鄉(xiāng)”，其橄欖品種多樣，栽培面積廣，產(chǎn)量大[3]。橄欖營養(yǎng)價(jià)值很高，含有人體所需多種維生素、氨基酸、多糖、黃酮等活性物質(zhì)，具有清熱、利咽、祛痰、生津、健脾、解毒等功效，是醫(yī)食兼優(yōu)的時(shí)令佳果[4-5]。目前，對于橄欖的研究主要針對其民間藥膳、防腐保鮮、果汁、蜜餞等方面，對其活性成分的研究還處于初步階段。

多糖是由一定數(shù)量的單糖通過一定的糖苷鍵脫水縮合成的多聚糖，是生命有機(jī)體不可缺少的組成部分，是生物體內(nèi)除蛋白質(zhì)和核酸以外又一類重要的生物大分子[6-7]。多糖參與了細(xì)胞的各種生命現(xiàn)象及生理過程的調(diào)節(jié)，具有多種生物學(xué)功能，如：抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力、抗氧化、降血糖、降血脂等[8-11]。多糖傳統(tǒng)水提法提取比較耗時(shí)、提取率低[12];酸堿提取法容易導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)的破壞，不利于后續(xù)構(gòu)效關(guān)系的研究[13-14];超聲波輔助法和微波輔助法操作簡單，且不會引入雜質(zhì)，多糖純度高，但多糖得率和產(chǎn)能有待提高[15]。尋找高得率且具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用潛力的提取方法至關(guān)重要。超聲微波協(xié)同提取法是近年發(fā)展起來的一種新方法，該方法充分利用超聲波的振動空化作用和微波的高能作用，具有高效、快速、安全和環(huán)保等特點(diǎn)，已被廣泛地應(yīng)用于天然產(chǎn)物有效成分的提取，尤其在色素、黃酮和多糖等活性物質(zhì)提取效果更好[16-17]。

因此，筆者采用超聲微波協(xié)同提取法提取橄欖多糖，在考察超聲波功率、微波功率和提取時(shí)間等3個(gè)單因素對多糖得率影響的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)確定超聲微波協(xié)同提取橄欖多糖的工藝條件，在此基礎(chǔ)上，對橄欖多糖酶法脫蛋白工藝進(jìn)行了研究，旨在為研究橄欖多糖的結(jié)構(gòu)、功能學(xué)特性及其綜合開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?材料與試劑 ? 橄欖購于福建省閩侯縣;木瓜蛋白酶，北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司;牛血清蛋白，上海勵(lì)瑞生物科技有限公司;考馬斯亮藍(lán)G-250，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;苯酚、濃硫酸、乙醇、石油醚、葡萄糖等均為國產(chǎn)分析純試劑;本試驗(yàn)用水均為雙蒸水。

1.1.2 ?儀器與設(shè)備 ? XH-300B微波超聲波組合催化合成萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;BCD-213KC型新飛冰箱，河南新飛電器有限公司;FZ102植物粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司;AL104型精密分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;丹瑞HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠;L530型臺式低速離心機(jī)，長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司;Unic-UV-2000型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司;鹵素快速水分測定儀，深圳市冠亞電子科技有限公司;SHA-B水浴恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司;LG-1.0型真空冷凍干燥機(jī)，新陽速凍設(shè)備制造有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?樣品前處理 ? 篩選出無任何機(jī)械損傷、病蟲害的新鮮果實(shí)，對其進(jìn)行清洗、去核，經(jīng)冷凍干燥后，粉碎過篩（100目），得到橄欖粉末（水分含量<3%），備用。

1.2.2 ?多糖的提取 ? 提取流程：橄欖粉末→超聲微波協(xié)同提取→離心→濾液→減壓濃縮→醇析→離心→沉淀→定容測定。

取2 g橄欖粉末加入100 mL水中，在不同超聲波功率、微波功率條件下提取不同時(shí)間，渾濁液經(jīng)離心后，取濾液經(jīng)減壓濃縮后靜置于4倍體積無水乙醇中沉降24 h，然后離心棄去上清液，沉淀經(jīng)定容后測定。重復(fù)3次。

1.2.3 ?多糖得率的測定 ? 以葡萄糖為標(biāo)樣，采用硫酸―苯酚比色法測定[18]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制：精確稱取干燥的葡萄糖標(biāo)樣20 mg，用500 mL蒸餾水定容，分別吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，并用蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，然后加入1.0 mL 6%苯酚，再迅速加入5.0 mL濃硫酸，顯色后在冷水中冷卻15 min，在波長490 nm處測定吸光度OD值，以蒸餾水代替葡萄糖作空白對照。

樣品測定：吸取1.0 mL樣品液按照上述步驟操作，在波長490 nm處測定吸光度OD值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖得率。

多糖得率計(jì)算公式：

多糖得率/%=■×100

1.2.4 ?蛋白質(zhì)含量測定 ? 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制：精確移取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為0.1 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置試管中，加入去離子水，使每支試管中溶液體積為1 mL，搖勻。然后每管中分別加入5.0 mL染色液，搖勻，室溫靜置3 min，于波長595 nm處測定吸光度OD值，以空白溶液作對照。

樣品測定：吸取1.0 mL樣品液按照上述步驟操作，在波長595 nm處測定OD值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。

1.2.5 ?超聲微波協(xié)同提取橄欖多糖 ? 單因素試驗(yàn)：取2 g金柑粉末，加入100 mL水，以橄欖多糖得率為指標(biāo)，研究超聲波功率、微波功率和提取時(shí)間對多糖得率的影響。

正交試驗(yàn)：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲波功率（X1）、微波功率（X2）、提取時(shí)間（X3）等3因素，各3個(gè)水平，以多糖得率為指標(biāo)，按L9（34）正交表試驗(yàn)，得出超聲微波協(xié)同提取橄欖多糖的最佳工藝參數(shù)。

1.2.6 ?橄欖多糖酶法脫蛋白 ? 單因素試驗(yàn)：精確稱取2 g橄欖多糖，配制成2 mg/mL，pH6.5多糖溶液，以脫蛋白率為指標(biāo)，研究木瓜蛋白酶酶解時(shí)不同的酶解溫度、酶解時(shí)間、酶添加量對脫蛋白率的影響。

正交試驗(yàn)：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶解溫度（X1）、酶解時(shí)間（X2）、酶添加量（X3）3因素，各3個(gè)水平，以脫蛋白率為指標(biāo)， 按L9（34）正交表做試驗(yàn)，得出橄欖多糖酶法脫蛋白的最佳工藝參數(shù)。

脫蛋白率計(jì)算公式：

脫蛋白率/%=■×100

公式中c1：脫蛋白前的蛋白質(zhì)濃度（μg/mL）;c2：脫蛋白后的蛋白質(zhì)濃度（μg/mL）。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線

多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=7.216 1x+0.041 5（r2=0.999 7）。表明0～0.08 mg/mL葡萄糖含量與y呈良好的線性關(guān)系。x—表示葡萄糖含量（mg/mL）;y—表示在波長490 nm處吸光度OD值。

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.006 4x+0.003（r2=0.999 7）。表明在0～100 μg/mL牛血清白蛋白溶液濃度與吸光度OD值呈良好的線性關(guān)系。x—表示牛血清白蛋白溶液濃度（μg/mL）;y—表示吸光度OD值。

2.2 ?超聲微波協(xié)同提取橄欖多糖工藝研究

2.2.1 ?超聲波功率對橄欖多糖得率的影響 ? 當(dāng)微波功率為100 W，提取時(shí)間為10 min條件下，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。超聲波功率在100～250 W時(shí)，多糖得率隨超聲波功率的增加而增加，但當(dāng)超聲波功率高于250 W時(shí)，多糖得率隨著超聲波功率增加而減少，這可能是由于過高的超聲波功率會導(dǎo)致多糖降解[19]。因此，選擇250 W為實(shí)驗(yàn)最佳的超聲波功率。

2.2.2 ?微波功率對橄欖多糖得率的影響 ? 當(dāng)超聲波功率為250 W，提取時(shí)間為10 min條件下，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。微波功率在25～150 W時(shí)，多糖得率隨微波功率增加而增加，但當(dāng)微波功率高于150 W時(shí)，多糖得率隨著微波功率增加而減少，這可能是由于過高的微波功率導(dǎo)致多糖降解[20]。因此，選擇150 W為實(shí)驗(yàn)最佳的微波功率。

2.2.3 ?提取時(shí)間對橄欖多糖得率的影響 ? 當(dāng)超聲波功率為250 W，微波功率為150 W條件下，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。提取時(shí)間在5～15 min時(shí)，多糖得率隨提取時(shí)間增加而增加，但當(dāng)提取時(shí)間超過15 min時(shí)，多糖得率隨著提取時(shí)間增加而減少，這可能是由于過長的超聲波和微波作用時(shí)間會使多糖分子鏈發(fā)生斷裂，從而降低多糖的得率。因此，選擇15 min為實(shí)驗(yàn)最佳的提取時(shí)間。

2.2.4 ?提取工藝的確定 ? 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，用正交試驗(yàn)對影響橄欖多糖得率的因數(shù)進(jìn)行條件優(yōu)化（表1）。

由表2可知，各因素對橄欖多糖得率的影響大小依次為：超聲波功率>微波功率>提取時(shí)間;超聲微波協(xié)同提取橄欖多糖的最佳工藝條件為：A2、B2和C2，即超聲波功率250 W，微波功率150 W，提取15 min。

由表3可知，超聲波功率和微波功率對橄欖多糖得率影響達(dá)極顯著水平，提取時(shí)間對橄欖多糖得率影響達(dá)顯著水平。在最佳工藝條件下，橄欖多糖得率為（10.6±0.3）%。

2.3 ?橄欖多糖酶法脫蛋白工藝研究

2.3.1 ?酶解溫度對脫蛋白率的影響 ? 當(dāng)酶解時(shí)間60 min，酶添加量50 U/g時(shí)，結(jié)果見圖4。酶解溫度在10～40 ℃時(shí)，脫蛋白率隨酶解溫度增加而增加，但當(dāng)酶解溫度超過40 ℃時(shí)，脫蛋白率隨著酶解溫度增加而減少，這可能是因?yàn)楫?dāng)溫度超過酶的最適反應(yīng)溫度后，酶蛋白質(zhì)變性，使得酶活力減弱，直至完全喪失活力，反應(yīng)速度隨著溫度升高迅速下降[21]。因此，選擇40 ℃為實(shí)驗(yàn)最佳的酶解溫度。

2.3.2 ?酶解時(shí)間對脫蛋白率的影響 ? 當(dāng)酶解溫度為40 ℃，酶添加量為50 U/g時(shí)，結(jié)果見圖5。當(dāng)酶解時(shí)間在40～70 min時(shí)，脫蛋白率隨酶解時(shí)間增加而增加，但當(dāng)酶解時(shí)間超過70 min時(shí)，脫蛋白率幾乎不變，這是由于酶解反應(yīng)時(shí)間和酶解進(jìn)行程度有密切的關(guān)系，反應(yīng)時(shí)間太短，酶解不充分;而當(dāng)酶濃度達(dá)到一定時(shí)，酶促反應(yīng)的時(shí)間延長并不能使脫蛋白率顯著增加[22]。因此，選擇70 min為實(shí)驗(yàn)最佳的酶解時(shí)間。

2.3.3 ?酶添加量對脫蛋白率的影響 ? 當(dāng)酶解溫度為40 ℃，酶解時(shí)間為70 min時(shí)，結(jié)果見圖6。酶添加量在30～60 U/g時(shí)，脫蛋白率隨酶添加量增加而增加，但當(dāng)酶添加量超過60 U/g時(shí)，脫蛋白率幾乎不變。因此，選擇60 U/g為實(shí)驗(yàn)最佳的酶添加量。

2.3.4 ?脫蛋白工藝的確定 ? 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，用正交試驗(yàn)對影響橄欖多糖脫蛋白率的因數(shù)進(jìn)行條件優(yōu)化（表4）。

由表5可知，各因素對橄欖多糖脫蛋白率的影響大小依次為：酶解溫度>酶解時(shí)間>酶添加量;橄欖多糖酶法脫蛋白的最佳工藝條件為：A′2、B′2和C′3，即酶解溫度40 ℃、酶解70 min，酶添加量70 U/g。

由表6可知，酶解溫度對橄欖多糖脫蛋白率影響達(dá)極顯著水平，酶解時(shí)間和酶添加量對橄欖多糖脫蛋白率影響達(dá)顯著水平。在最佳工藝條件下，橄欖多糖脫蛋白率為（77.0±2.5）%。

3 ?討論與結(jié)論

超聲波-微波協(xié)同法將振動超聲與開放式微波兩種作用方式相結(jié)合。充分利用超聲振動的空化作用以及微波的高能作用，使樣品各點(diǎn)內(nèi)受到的作用一致。降低目標(biāo)物與樣品基體的結(jié)合力，加速目標(biāo)物從固相進(jìn)入溶劑的過程。而單獨(dú)微波輔助提取法主要是利用微波穿透強(qiáng)、加熱快的特點(diǎn)，使植物細(xì)胞內(nèi)迅速產(chǎn)生大量的熱量，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的壓力，沖破細(xì)胞，使活性成分溶出。李永裕等[23]橄欖多糖微波輔助提取工藝研究中，采用微波前處理-熱水浸提，在最優(yōu)條件下得到的橄欖多糖得率為9.38%，相比本研究結(jié)果有所提高。

超聲微波協(xié)同提取法充分利用了超聲波的振動空化作用和微波的高能作用，提取效率高，多糖純度高。超聲微波協(xié)同提取法是一種快速有效的提取橄欖多糖方法，但各種提取方法對橄欖多糖結(jié)構(gòu)和活性的影響有待進(jìn)一步研究。

傳統(tǒng)脫蛋白方法有鹽析法、TCA法、Sevag法，都存在著有機(jī)溶劑量大，耗時(shí)長，水相與有機(jī)相的分離，容易造成損失等缺點(diǎn)?，F(xiàn)嘗試以酶法脫除多糖中的蛋白質(zhì)，以期為將來的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。酶法能有效除去橄欖粗多糖中蛋白質(zhì)雜質(zhì)，本研究使用木瓜蛋白酶脫除橄欖粗多糖的蛋白質(zhì)，相較于之前賈媛穎[24]用SEVAGE法脫除蛋白方法，不引入有機(jī)試劑，因而能夠較好應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，為進(jìn)一步研究橄欖多糖理化性質(zhì)、分離純化、結(jié)構(gòu)表征、構(gòu)效關(guān)系及其綜合開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

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