張珂 陳華姑 龔勝 孫海燕 王健

海南大學(xué)園藝園林學(xué)院熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ?海南?？?570228

摘 ?要 ?采用新型材料MonoTrap作為頂空固相萃取的吸附劑，捕集茉莉酸甲酯（MeJA）處理后的白木香愈傷組織揮發(fā)性成分，并應(yīng)用GC-MS分析測(cè)定其化學(xué)成分及相對(duì)含量。結(jié)果表明，從MeJA不同處理下的白木香愈傷組織中共鑒定出56種揮發(fā)物成分，主要成分為脂肪烴類、芳香族類和倍半萜類等成分;通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)法確定最佳捕集方法為：不破碎愈傷組織材料，于30 ℃條件下、采用MonoTrap捕集6 h。MonoTrap法結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用具有高靈敏度、強(qiáng)針對(duì)性和可操作性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可以為白木香的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 ?白木香;愈傷組織;揮發(fā)性成分;MonoTrap;氣相色譜-質(zhì)譜

中圖分類號(hào) ?R284 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

GC-MS Analysis on the Volatile Constituents Adsorbed with Mono Trap from Callus of Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg.

ZHANG Ke， CHEN Huagu， GONG Sheng， SUN Haiyan， WANG Jian*

College of Horticulture & Landscape Architecture， Hainan University，/Key Laboratory of Protection and Development

Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract ?A novel material MonoTrap was used as the adsorbent of headspace solid phase extraction to absorb the volatile constituents from the MeJA-treated callus of Aquilaria sinensis. Then， the chemical constituents and relative contents of the volatile components were analyzed by GC-MS. The results showed that there were 56 compounds found in the MeJA-treated callus of A. sinensis， in which， the main constituents were aliphatic hydrocarbons， sesquiterpenoids and aromatics. The best absorbing method according to the results of orthogonal experimental was： non-broken callus materials， 30 ℃， absorbing for 6 h. MonoTrap coupled with GC-MS had advantages of high sensitivity， strong pertinence and operability. The study can provide a simpler and more flexible method for the volatile constituents analysis of A. sinensis（Lour.）Gilg.

Key words ?Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg;Callus;Volatile components;MonoTrap;Gas Chromatography-Mass Spectrometry

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.024

白木香[Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg.]又名土沉香、牙香樹(shù)、女兒香、香材、芫香，為瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria）植物，是一種熱帶、亞熱帶常綠喬木，產(chǎn)于廣東、海南、廣西、福建等省區(qū)[1]。其含樹(shù)脂的木材稱為沉香，為《中國(guó)藥典》收載的品種;味辛、苦、溫，歸脾、胃、腎經(jīng)，具有降氣、溫中、暖腎助陽(yáng)的功能;主治胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等癥[2]。長(zhǎng)期以來(lái)由于森林資源、生態(tài)環(huán)境遭受自然災(zāi)害和人為破壞，白木香野生資源破壞極其嚴(yán)重，瀕臨滅絕，現(xiàn)已被列為國(guó)家三級(jí)珍稀瀕危保護(hù)植物及國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物[3-4]，并被載入《中國(guó)植物紅皮書(shū)》[5]，為中國(guó)特有的珍貴藥用植物。

沉香藥效的主要有效成分是沉香揮發(fā)油，以倍半萜類和芳香族化合物為主，此外還含有脂肪酸及脂肪烷類等物質(zhì)[6]。近年來(lái)，有學(xué)者提出“白木香防御反應(yīng)結(jié)香假說(shuō)”和“激發(fā)子誘導(dǎo)結(jié)香假說(shuō)”[7-8]，認(rèn)為茉莉酸甲酯（MeJA）作為“激發(fā)子”可誘導(dǎo)白木香產(chǎn)生防御反應(yīng)，生成具有抑菌活性的防御類物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物途徑。日本學(xué)者Ito等[9]，Okudera[10]在無(wú)菌條件下，將MeJA加入白木香懸浮細(xì)胞中，誘導(dǎo)產(chǎn)生了α-愈創(chuàng)木烯（α-guaiene）、α-葎草烯（α-humulene）和δ-愈創(chuàng)木烯（δ-guaiene）。Xu等[11]采用固相微萃取技術(shù)（SPME）結(jié)合GC-MS檢測(cè)分析白木香愈傷組織揮發(fā)性成分，在未經(jīng)處理的健康的白木香愈傷組織中只發(fā)現(xiàn)有α-愈創(chuàng)木烯和δ-愈創(chuàng)木烯2種倍半萜;在MeJA處理后的白木香愈傷組織中發(fā)現(xiàn)有4種倍半萜，這些物質(zhì)可能是白木香防御類物質(zhì)和沉香類前體物質(zhì)。

目前，白木香少量組織的揮發(fā)性成分的鑒定主要用SPME技術(shù)[9-11]。SPME技術(shù)是一種新型的無(wú)溶劑樣品預(yù)處理技術(shù)，但存在價(jià)格昂貴、萃取頭易碎且需要進(jìn)行高溫解吸處理、聚合物圖層性質(zhì)不穩(wěn)定、易產(chǎn)生樣品攜帶等缺陷[12]。固相萃取整體捕集劑MonoTrap是用于捕集和萃取的新生代介質(zhì)，是集硅膠、活性炭、ODS特性為一體的高交聯(lián)性新吸附劑，優(yōu)點(diǎn)在于其硅膠骨骼里混合了活性炭，對(duì)極性物質(zhì)、低沸點(diǎn)物質(zhì)、芳烴的吸附有很大作用;可吸附包括在任何基質(zhì)中的揮發(fā)性、不揮發(fā)性、極性（中性或酸性）、非極性、液態(tài)及氣態(tài)物質(zhì);既可用少量有機(jī)溶劑萃取，也可用熱脫附共色譜分析，十分適合少量和微量材料的揮發(fā)性成分捕集，不需要對(duì)萃取成分進(jìn)行高溫解吸處理，且方便攜帶，比常用的SPME使用方法更靈活，靈敏度更高[13]，在香味成分、食品、環(huán)境的濃縮分析、篩選分析中，作為捕集工具的使用越來(lái)越多[14]。

筆者采用MonoTrap法捕集經(jīng)過(guò)MeJA處理的白木香愈傷組織揮發(fā)性成分，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分析研究，探索該檢測(cè)方法的有效捕集條件，驗(yàn)證該方法檢測(cè)白木香愈傷組織揮發(fā)性成分的有效性，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用白木香提供科學(xué)依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試白木香采自海南大學(xué)農(nóng)科實(shí)驗(yàn)基地;愈傷組織由本實(shí)驗(yàn)室用三年生白木香幼嫩莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)生成。

HP6890/5973型GC/MS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)惠普公司）;ABJ220-4M電子分析天平（德KERN）;KQ-50B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;QYN100-2氮吹儀（上海喬躍電子有限公司）;固相萃取整體捕集劑DCC18 MonoTrap（上海島津GL生物技術(shù)有限公司）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?MonoTrap法捕集白木香愈傷組織揮發(fā)性成分 ? 將白木香愈傷組織轉(zhuǎn)接入含100 μmol/L MeJA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)置吸附時(shí)間（A）、溫度（B）、材料處理（C）3個(gè)因素作為變量，采用L9（34）正交表優(yōu)化試驗(yàn)條件。各因素設(shè)3個(gè)水平：吸附時(shí)間設(shè)1、6、12 h;溫度設(shè)30、60、40 ℃;材料處理設(shè)機(jī)械破碎，不破碎和室溫下風(fēng)干0.5 h。各處理均準(zhǔn)確稱取0.6 g經(jīng)MeJA處理后的愈傷組織，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行材料處理，分別放入20 mL樣品瓶里，將1片MonoTrap DCC18懸于樣品瓶中的頂空固定架上，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)溫度與時(shí)間，頂空捕集白木香愈傷組織揮發(fā)性成分。揮發(fā)性成分采集完成后，將MonoTrap取出置于塑料襯管中，加二氯甲烷1mL超聲萃取5 min，取上清液于1.5 mL離心管中，氮吹濃縮至100 μL，作為GC-MS檢查樣品。

1.2.2 ?GC-MS分析條件 ? 氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS 5%Pheny Methy Siloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫60 ℃（保留2 min），以6 ℃/min升至300 ℃，保持4 min，汽化室溫度250 ℃;載氣為高純He（99.999%），柱前壓0.526 bar，載氣流量1.0 mL/min;進(jìn)樣量1 μL;分流比20 ∶ 1。

質(zhì)譜條件：離子源為EI源;離子源溫度為230 ℃;四極桿溫度150 ℃;電子能量70 eV;發(fā)射電流34.6 μA;倍增電壓837 V;接口溫度280 ℃;質(zhì)量范圍50～500 amu。

1.3 ? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

1.3.1 ?正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) ? 正交試驗(yàn)結(jié)果以有無(wú)捕集到倍半萜類物質(zhì)為考核指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分，捕集到0種的處理記1分，捕集到1種的處理記3分，捕集到2種的處理記6分，捕集到3種的處理記9分，捕集到4種的處理記10分。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn)的直觀分析與方差分析。

1.3.2 ?GC-MS分析與鑒定 ? 用毛細(xì)管色譜法對(duì)白木香愈傷組織揮發(fā)性成分進(jìn)行分離及含量分析;用色譜峰面積歸一化法測(cè)得各組分的相對(duì)含量;用氣相色譜-質(zhì)譜總離子流色譜檢測(cè)得GC-MS總離子流圖;所得色譜和質(zhì)譜信息利用計(jì)算機(jī)NIST11.L質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)自動(dòng)檢索和人工解析，確定化合物名稱及相對(duì)含量。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?MonoTrap法萃取最佳條件的確定

最佳萃取條件的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。通過(guò)對(duì)表1相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀分析可見(jiàn)：A2>A3>A1，B1>B2>B3，C2>C3>C1，A2，B1，C2的水平較好，最佳萃取組合為A2B1C2;3因素對(duì)愈傷組織揮發(fā)性成分的影響順序?yàn)镃>B>A。根據(jù)以上結(jié)果，確定MonoTrap法頂空捕集白木香愈傷組織揮發(fā)性成分的條件為：不破碎愈傷組織材料，于30 ℃捕集6 h。

2.2 ?氣相色譜-質(zhì)譜的分析與鑒定

經(jīng)過(guò)正交試驗(yàn)處理，分別獲得9個(gè)捕集條件下白木香愈傷組織揮發(fā)性成分總離子流圖（圖1）。

對(duì)9個(gè)處理獲得的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析合并，將其名稱及相對(duì)含量按照保留時(shí)間排列順序如表2。實(shí)驗(yàn)共鑒定出Monotrap捕集不同處理下白木香愈傷組織中的56個(gè)化合物，占揮發(fā)性物質(zhì)總量的48.83%。由表2可知，白木香愈傷組織揮發(fā)性成分中脂肪烴類含量最高，平均含量達(dá)38.57%，其次為芳香族類，平均含量達(dá)7.90%，9個(gè)處理共檢出4種倍半萜成分。十八烷、二丁基羥基甲苯、四甲基十六烷、二十一烷、二十四烷和3-（3，5-二叔丁基-4-羥基苯基）丙酸甲酯等化合物在9種處理中均能檢出，相對(duì)百分含量也大致相同，說(shuō)明這些成分在不同捕集條件下?lián)]發(fā)比較穩(wěn)定。而個(gè)別揮發(fā)性成分在不同處理中差異相當(dāng)大，如鄰苯二甲酸二異辛酯僅在處理1和6中檢出，且含量差異很大，說(shuō)明該成分對(duì)不同的捕集條件比較敏感。

對(duì)檢測(cè)到的β-欖香烯、α-愈創(chuàng)木烯、α-葎草烯、δ-愈創(chuàng)木烯4種倍半萜類物質(zhì)的分析結(jié)果如下：處理1、6和8為破碎愈傷組織材料，均未能檢測(cè)出，說(shuō)明材料破碎會(huì)極大影響倍半萜成分的揮發(fā);處理3和9為40 ℃條件下萃取，均有檢測(cè)出β-欖香烯，處理2和5為60 ℃條件下萃取，均有檢測(cè)出α-愈創(chuàng)木烯和δ-愈創(chuàng)木烯，說(shuō)明不同溫度處理可影響倍半萜類化合物種類的萃取;處理7檢測(cè)出β-欖香烯、α-愈創(chuàng)木烯、δ-愈創(chuàng)木烯3種倍半萜成分;處理4檢測(cè)出β-欖香烯、α-愈創(chuàng)木烯、α-葎草烯、δ-愈創(chuàng)木烯4種倍半萜成分，且僅有處理4檢出了α-葎草烯?？傮w來(lái)看，這4類倍半萜成分對(duì)捕集條件比較敏感。

3 ?討論與結(jié)論

從本研究結(jié)果看，所有愈傷組織破碎條件下的處理都沒(méi)有檢測(cè)出倍半萜類特征性成分，可見(jiàn)愈傷組織破碎可嚴(yán)重影響倍半萜類物質(zhì)的檢出，可能是因?yàn)檩葡╊惢衔飿O不穩(wěn)定，在細(xì)胞破碎時(shí)發(fā)生了一系列化學(xué)反應(yīng)[15]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明萃取溫度和吸附時(shí)間均對(duì)白木香愈傷組織揮發(fā)性成分有一定影響。從吸附時(shí)間結(jié)果來(lái)看，吸附6 h的檢出效果好于吸附1 h， 說(shuō)明隨著處理時(shí)間增加，愈傷組織揮發(fā)的倍半萜類種類增加，符合揮發(fā)物隨時(shí)間增加而增多的一般規(guī)律，但到了12 h又有所下降（表1），原因可能是長(zhǎng)時(shí)間處理下，Monotrap吸附材料對(duì)萜烯類的吸附能力加強(qiáng)，導(dǎo)致后期二氯甲烷對(duì)這些成份洗脫困難而不易檢測(cè)出。從吸附溫度來(lái)看，高溫條件下檢出效果明顯比30 ℃時(shí)差（表1），說(shuō)明高溫會(huì)減少萜烯類成份的揮發(fā)與檢測(cè)，可能是愈傷組織細(xì)胞在高溫脅迫下，隨脅迫時(shí)間增加，細(xì)胞活力逐漸降低，膜質(zhì)過(guò)氧化程度逐漸增加[16]，導(dǎo)致倍半萜類物質(zhì)的損失?？傮w來(lái)看，白木香愈傷組織揮發(fā)性成份中倍半萜類成分含量很低且穩(wěn)定性較差（表2），因此對(duì)材料前期處理比較敏感，破碎、高溫、吸附時(shí)間過(guò)長(zhǎng)均會(huì)減少其檢出效果，所以檢測(cè)時(shí)材料應(yīng)保持自然狀態(tài)。白木香是一種典型的傷害誘導(dǎo)型藥用植物，只有在傷害等脅迫條件或外界刺激誘導(dǎo)下才能夠在其木質(zhì)部?jī)?nèi)產(chǎn)生倍半萜等沉香類物質(zhì)[17]。戚樹(shù)源等[18]分析檢測(cè)在健康白木香木材組織中沒(méi)有沉香倍半萜類成分，其主要成分為棕櫚酸、油酸和亞油酸等脂肪酸與本研究檢測(cè)到的揮發(fā)性成分有較大的差異，證明誘導(dǎo)作用是產(chǎn)生這些防御類物質(zhì)和沉香倍半萜類前體物質(zhì)的重要條件。Ito等[9-10，17]在經(jīng)過(guò)MeJA處理的白木香懸浮細(xì)胞或莖干中，檢測(cè)到了α-愈創(chuàng)木烯（α-guaiene）、α-葎草烯（α-humulene）和δ-愈創(chuàng)木烯（δ-guaiene）等成分，與本研究結(jié)果類似。但這些研究中一般只檢測(cè)到3種倍半萜類物質(zhì)，而本研究則檢測(cè)出4種倍半萜類物質(zhì)，在白木香愈傷組織檢測(cè)出β-欖香烯，說(shuō)明本方法具有更高的靈敏性。β-欖香烯具有氣特異、微香的特性，同時(shí)β-欖香烯還具有抑制轉(zhuǎn)移、抗多藥耐藥、抗腫瘤免疫、化療增效、放療增敏等作用[19]。

本研究結(jié)果也可以看出，不同的處理檢測(cè)出的成分種類及含量有較大的差異，說(shuō)明該方法對(duì)捕集條件靈敏地響應(yīng)。由于白木香不同品種、不同部位作為外植體，不同培養(yǎng)條件，不同誘導(dǎo)方式等因素，會(huì)導(dǎo)致愈傷組織中倍半萜和芳香族物質(zhì)種類和含量存在較大差異，因此不同條件下白木香愈傷組織中倍半萜成分檢測(cè)的捕集條件還需要進(jìn)一步有針對(duì)性的優(yōu)化，才能獲得更為理想的結(jié)果。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國(guó)科學(xué)院“中國(guó)植物志”編輯委員會(huì). 中國(guó)植物志[第52（1）卷][M]. 北京： 科學(xué)出版社， 1999： 290.

[2] 中華人民共和國(guó)藥典編委會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S]. 北京： 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2010： 128-129.

[3] 國(guó)家環(huán)境保護(hù)局， 中國(guó)科學(xué)院植物研究所.中國(guó)珍稀瀕危保護(hù)植物名錄（第一冊(cè)）[M]. 上海： 上海科技教育出版社， 1987： 94.

[4] 國(guó)家林業(yè)部， 國(guó)家農(nóng)業(yè)部.國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄（第一批）[S]. 1999年8月4日國(guó)務(wù)院批準(zhǔn)[J]. 環(huán)境教育， 2008（7）： 84.

[5] 中國(guó)科學(xué)院植物研究所. 中國(guó)植物紅皮書(shū)-稀有瀕危植物[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 1992： 670-671.

[6] 郭曉玲，田佳佳，高曉霞，等. 不同產(chǎn)區(qū)沉香藥材揮發(fā)油成分GC-MS分析[J]. 中藥材， 2009， 32（9）： 1 354-1 358.

[7] 張 ?爭(zhēng)， 楊 ?云， 魏建和，等. 白木香結(jié)香機(jī)制研究進(jìn)展及其防御反應(yīng)誘導(dǎo)結(jié)香假說(shuō)[J]. 中草藥， 2010， 41（1）： 156-159.

[8] 朱智強(qiáng). 白木香的結(jié)香機(jī)理及造香技術(shù)[J]. 熱帶林業(yè)， 2013， 41（3）： 31-33.

[9] Ito M， Okimoto K， Yagura T， et al. Induction of sesquiterpenoid production by ?methyl jasmonate in Aquilaria sinensis cell suspension culture[J]. Journal of Essential Oil Research， 2005， 17： 175-180.

[10] Okudera Y， Ito M. Production of agarwood fragrant constituents in Aquilaria calli and cell suspension cultures[J]. Plant Biotechnology， 2009， 26： 307-315.

[11] Xu Y H， Zhang Z， Wang M X， et al. Identification of genes related to agarwood formation： transcriptome analysis of healthy and wounded tissues of Aquilaria sinensis[J]. BMC Genomics，2013， 14： 227.

[12] 汪瑾彥， 陳大舟， 湯 ?樺，等. 水體沉積物和土壤中多環(huán)芳烴的分析方法研究[J]. 現(xiàn)代儀器， 2010， 16（2）： 11-15.

[13] 佐藤睦， 外丸騰彥， 武田まなゐ，等. 運(yùn)用新生代型整體構(gòu)造高交聯(lián)吸附劑“MonoTrap”進(jìn)行樣品捕集、 加熱脫附、 有機(jī)溶劑萃取的方法研討[C]. 第十七屆全國(guó)色譜學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)論文集，2009： 868-868.

[14] 王 ?晨. 不同桂花品種的香氣成分分析及紅外光譜鑒定模型初步建立[D]. 南京： 南京林業(yè)大學(xué)， 2012.

[15] 張赟彬， 繆存鉛，崔儉杰. 吹掃/捕集-熱脫附氣質(zhì)聯(lián)用法對(duì)荷葉揮發(fā)油成分的對(duì)比分析[J]. ?化學(xué)學(xué)報(bào)， 2009， 67（20）： 2 368-2 374.

[16] 鞏慧玲. 植物愈傷組織對(duì)高溫脅迫的生理響應(yīng)及G6PDH對(duì)高溫適應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)理研究[D]. 蘭州： 蘭州大學(xué)， 2011.

[17] 張 ?爭(zhēng)， 楊 ?云， 魏建和，等. 白木香莖中內(nèi)源茉莉酸類和倍半萜類物質(zhì)對(duì)機(jī)械傷害的響應(yīng)[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2013， 40（1）：163-168.

[18] 戚樹(shù)源， 陸碧瑤， 朱亮峰，等. 白木香中白木香醛形成的研究[J]. 植物生理學(xué)通訊， 1992， 28（5）： 336-339.

[19] 王宏虹， 劉華鋼， 劉麗敏. β-欖香烯抗腫瘤作用機(jī)制研究概況[J]. 藥物評(píng)價(jià)研究， 2009， 32（2）： 140-143.