柳麗松 殷紅等

摘要：目的 觀察銀翹散對呼吸道黏膜免疫功能低下合并流感病毒感染模型小鼠的影響，并探討其作用機制。方法 復制寒冷刺激致小鼠上呼吸道黏膜免疫功能低下模型，采用甲型流感病毒鼠肺適應株A/PR/8/34 （H1N1）通過鼻腔接種方式感染模型小鼠，將小鼠隨機分為正常組、模型組、陽性藥（利巴韋林）組及銀翹散組，各給藥組給予相應藥物灌胃，觀察各組小鼠死亡率、生命延長率、平均存活時間及肺指數。結果 與模型組比較，陽性藥組、銀翹散組小鼠死亡率明顯降低（P<0.05，P<0.01），存活時間延長；陽性藥組、銀翹散組小鼠肺指數明顯降低（P<0.05，P<0.01），肺指數抑制率分別為35.5%、24.6%。結論 銀翹散通過上調模型小鼠上呼吸道局部黏膜免疫功能，達到防治上呼吸道感染的作用。

關鍵詞：銀翹散；流感；黏膜免疫；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.019

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）08-0070-03

Effects of Yinqiao Powder on Mouse Models with Upper Respiratory Trace Mucosal Immunity Dysfunction Infected with Influenza Virus A LIU Li-song， YIN Hong， WANG Wei-li， YAN Han-wen， LIN Qing， Lei Na （Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China）

Abstract：Objective To observe the effect of Yinqiao Powder on the mouse models with upper respiratory trace mucosal immunity dysfunction infected with influenza virus A， and explore mechanism of action. Methods The mouse models of upper respiratory trace mucosal immunity dysfunction induced by cold stimulation with the influenza A/PR/8/34 （H1N1） virus through the nasal cavity were established. The mice were randomly divided into normal group， model group， positive medicine （Ribavirin） group， and Yinqiao Powder group. All administration groups received gavage with relevant medicine， and then mortality， the life prolonging rate， average survival time and the lung index of each group were observed. Results Compared with the model group， the mortalities in positive medicine group and Yinqiao Powder group decreased significantly （P<0.05， P<0.01）， with longer survival time. The lung indexes in positive medicine group and Yinqiao Powder group decreased significantly （P<0.05， P<0.01）， and the inhibition ratios of lung index were 35.5% and 24.6%， respectively. Conclusion Yinqiao Powder can realize the protective effects on upper respiratory infection through upregulating the mucosal immunity of the upper respiratory tract of mouse models.

Key word：Yinqiao Powder；influenza；mucosal immunity；mice

基金項目：國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥重點建設學科-培育學科（2012年）；云南省優(yōu)勢特色重點學科（群）建設項目（2011-2015年）；云南省科技計劃青年項目（2013FD035）；云南白藥、云南中醫(yī)學院中醫(yī)藥教育創(chuàng)新基金項目（YB2014Y02）

通訊作者：雷娜，E-mail：492078820@qq.com

急性上呼吸道感染（以下簡稱“上感”）是臨床常見的呼吸道傳染病，70%～80%由病毒感染引起，僅少部分由細菌感染引起，病毒感染后亦可繼發(fā)細菌感染，且易引起支氣管炎及肺炎。采取抗病毒、抗菌的對因治療及解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎的對癥治療是治療上感的主要方法，但由于目前用于上感治療的抗病毒藥物

僅對一種或幾種病毒有效，加之病毒具有亞型多樣性及快速變異性的特點，導致藥物對因治療的困難，非甾體類抗炎藥物僅限于改善臨床癥狀。因此，積極尋找防治上感的有效藥物具有重要的現實意義。前期研究表明，解表方銀翹散能提高模型小鼠呼吸道黏膜免疫功能[1]。本研究采用鼻腔接種甲型流感病毒鼠肺適應株A/PR/8/34（H1N1）感染呼吸道黏膜免疫功能低下小鼠模型，觀察銀翹散的體內抗流感病毒的作用，并探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

ICR小鼠，SPF級，5周齡，雌雄各半，體質量18～22 g，北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號SCXK（京）2009-0004，飼養(yǎng)于云南中醫(yī)學院SPF級實驗動物中心。

1.2 藥物、主要試劑與儀器

按《方劑學》[2]銀翹散的組成（連翹30 g，金銀花30 g，桔梗18 g，薄荷18 g，牛蒡子18 g，淡竹葉12 g，甘草15 g，荊芥穗12 g，淡豆豉15 g），飲片均購自昆明一心堂大藥房；利巴韋林片，江西匯仁藥業(yè)有限公司，批號1302009。按人和動物的體表面積計算法[3]，根據臨床藥量換算出小鼠銀翹散用量為21.84 g/kg利巴韋林用量為0.15 g/kg，給藥體積均為0.2 mL/10 g。乙醚，云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司，批號101030；-80 ℃超低溫冰箱，美國Thermo公司；-20 ℃冰箱，伊萊克斯公司。

1.3 病毒株

甲型流感病毒鼠肺適應株A/PR/8/34（H1N1），四川大學華西醫(yī)學中心提供，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法與結果

2.1 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料用—x±s表示，組間比較采用方差分析；計數資料采用卡方檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2.2 上呼吸道黏膜免疫功能低下模型小鼠半數致死量測定

取凍存流感病毒液，復融后用生理鹽水10倍連續(xù)稀釋為10-1～10-66個濃度組備用，正常組給予生理鹽水。實驗小鼠隨機分為7組，雌雄各半，每組10只。復制上呼吸道黏膜免疫功能低下模型[1]，室溫下適應30 min，乙醚輕度麻醉，用移液槍經小鼠鼻腔接種10-1～10-6流感病毒液，0.05 mL/只，連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠死亡數，按Reed-Muench法[2]計算流感病毒對小鼠的半數致死量（LD50）。測得本室保存的甲型流感病毒鼠肺適應株H1N1感染小鼠的LD50值為3.33。將病毒液做10-3.33稀釋接種，可引起50%小鼠死亡，見表1。

2.3 銀翹散對黏膜免疫功能低下合并流感病毒感染模型小鼠的影響

將小鼠隨機分為正常組、模型組、陽性藥組及銀翹散組，每組20只。復制寒冷刺激致上呼吸道黏膜免疫功能低下小鼠模型[1]，小鼠室溫下適應30 min，采用乙醚輕度麻醉小鼠，用移液槍經小鼠鼻腔接種引起小鼠LD50濃度流感病毒0.05 mL/只，陽性藥（利巴韋林）組及銀翹散組在滴鼻感染流感病毒前2 d開始給藥，感染后1 h再給藥1次，連續(xù)5 d，1次/d，記錄14 d各組小鼠死亡數和平均存活時間及生命延長率。結果表明，與正常組比較，流感病毒感染模型小鼠死亡率為60%，陽性藥組、銀翹散組小鼠死亡率分別為15%、25%（P<0.05，P<0.01），延長模型小鼠平均生存時間，見表2。

（下同）

2.4 銀翹散對黏膜免疫功能低下合并流感病毒感染模型小鼠肺指數的影響

實驗動物分組、給藥、造模及接種病毒方法同“2.3”項，小鼠于感染后第6日稱重后摘眼球放血處死，取全肺稱重，計算肺指數（全肺質量÷體質量×100%）及肺指數抑制率[（模型組平均肺指數-給藥組平均肺指數）÷模型組平均肺指數×100%]。結果表明，利巴韋林、銀翹散均能抑制模型小鼠肺指數（P<0.05，P<0.01），肺指數抑制率分別為35.5%、24.6%。銀翹散組與陽性藥組比較無明顯差異，見表3。

3 討論

辨證論治是中醫(yī)理論的核心，是中醫(yī)臨床診斷、治療疾病的基本原則。臨床實踐中，以中醫(yī)理論為指導，對由癥狀組成的證候進行證的分辨確認，從而立法、選方、遣藥對疾病進行治療。惡寒、發(fā)熱、鼻塞、噴嚏、流鼻涕、咳嗽、咽喉癢痛等是上感的主要癥狀，這些與中醫(yī)表證的癥狀極其相似，中醫(yī)往往將其歸于表證的范疇進行辨證治療[4]。根據辨證不同分別采用辛溫解表的麻黃湯、辛涼解表的銀翹散等解表方進行治療，其中銀翹散是臨床上防治上感使用最為廣泛、療效較好的方劑[5-6]。但已有的對其防治上感的機制研究主要集中于解熱、抗炎、抗病原體等方面[7]，其藥效與化學藥物相比并未表現出優(yōu)勢，難以解釋其對上感良好的臨床療效。

為探究解表方防治上感的機制，本課題組前期基于呼吸道黏膜免疫功能低下是發(fā)生上感的重要條件的事實，建立了寒冷致小鼠上呼吸道黏膜免疫功能低下模型[1]，表明銀翹散能提高模型小鼠上呼吸道黏膜免疫功能，對上呼吸道黏膜免疫功能低下合并鼻腔接種肺炎鏈球菌小鼠有生存保護作用，但對腹腔感染肺炎鏈球菌的模型無保護作用，也無體外抗菌作用。因此，我們認為銀翹散可能是通過上調模型小鼠上呼吸道局部黏膜免疫功能，達到防治上感的作用[7]。由于上感主要由病毒感染引起，因此，本實驗在寒冷致小鼠呼吸道黏膜免疫功能低下的模型基礎上，采用鼻腔接種H1N1感染小鼠，觀察銀翹散體內抗流感病毒的作用，為進一步研究銀翹散藥防治上感的確切作用機制提供實驗基礎。

死亡率是一種表示宿主易感性及藥物對病毒感染宿主的保護作用的實驗指標，可從整體水平反映藥效；對病毒感染動物生存的保護，包含藥物對病毒增殖的抑制作用，也涉及藥物對病毒感染機體的保護及對相應毒素的對抗作用。因此，動物的生存保護作用是研究中藥抗病毒作用的常用指標。流感病毒感染后期常引起病毒性肺炎，因此，肺指數可作為流感病毒感染情況的指標[8]。

實驗結果顯示，銀翹散對黏膜免疫功能低下合并鼻腔接種流感病毒小鼠有生存保護作用，能夠降低模型小鼠死亡率、延長其生存時間、抑制肺指數。結合前期研究，銀翹散不僅對黏膜免疫功能低下模型小鼠合并細菌感染有效，對黏膜免疫功能低下模型小鼠合并病毒感染也有效。因此，不能僅以抗病毒或抗菌解釋其臨床防治上感的作用。本研究結果表明，銀翹散防治上感的作用與提高上呼吸道黏膜免疫功能有關。

參考文獻：

[1] 李嫻，雷娜，段小花，等.寒冷刺激致小鼠上呼吸道黏膜免疫功能低下模型的研究[J].中國病理生理雜志，2011，27（8）：1662-1664.

[2] 鄧中甲.方劑學[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：30.

[3] 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：203.

[4] 余如瑾，唐光華，姜良鐸.淺談中醫(yī)防治呼吸道病毒感染性疾病的辨治及研究思路[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2003，10（7）：79.

[5] 馮勁立，馬霄行，周崇俊，等.三種解表方法對小鼠免疫功能影響的實驗研究[J].世界中西醫(yī)結合雜志，2007，2（5）：268-270.

[6] 周遠鵬.銀翹解毒片的藥理研究[J].中成藥，1990，12（1）：22-25.

[7] 雷娜，李艷，何芳雁，等.解表方通過調節(jié)黏膜免疫保護上呼吸道感染模型小鼠的研究[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（18）：174-176.

[8] Boeckh M， Englund JA. Evaluation of therapeutics for RSV：an important step forward[J]. Am J Respir Crit Care Med，2010， 182（10）：1217-1219.

（收稿日期：2015-02-09）

（修回日期：2015-02-26；編輯：華強）