賁銀銀，朱景玙，徐建青，張曉燕

上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

馬納維諾與西夫韋肽體外聯(lián)合抗人類(lèi)免疫缺陷病毒感染的效果評(píng)價(jià)

賁銀銀*，朱景玙*，徐建青，張曉燕

上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

本文旨在探討人類(lèi)免疫缺陷病毒1型(HIV-1)CC趨化因子受體5(CCR5)輔助受體拮抗劑馬納維諾(MRV)與膜融合抑制劑西夫韋肽(SFT)在抗HIV感染中的協(xié)同作用。利用TZM-bl細(xì)胞系檢測(cè)SFT和MRV單用或聯(lián)用對(duì)3種CCR5噬性(SVPB16、SVPC12和CRF01_AE)HIV假病毒的半數(shù)有效濃度(EC50)。采用CalcuSyn軟件對(duì)2種藥物的協(xié)同性進(jìn)行預(yù)測(cè)，聯(lián)合指數(shù)(CI)＜1為有協(xié)同作用，CI=1為有相加效應(yīng)，CI＞1為有拮抗作用。同時(shí)，應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)法對(duì)MRV和SFT的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，2種藥物單用時(shí)對(duì)SVPB16、SVPC12和CRF01_AE的EC50:SFT為0.91、0.17、0.71 nmol/L，MRV為4.84、0.47、0.45 nmol/L。針對(duì)這3種假病毒，聯(lián)用比單用EC50均有所降低，SFT(0.45、0.09、0.15 nmol/L)降低1～4倍，MRV (1.52、0.12、0.11 nmol/L)降低2～3倍。2種藥物聯(lián)用對(duì)3種假病毒抑制率達(dá)90%時(shí)的CI值分別為0.28、0.59和0.36。等效線(xiàn)法顯示兩者之間存在良好的協(xié)同作用。綜上所述，聯(lián)用MRV與SFT在不產(chǎn)生細(xì)胞毒性的情況下具有良好的協(xié)同抗HIV效果。

人類(lèi)免疫缺陷病毒;藥物協(xié)同作用;半數(shù)有效濃度;馬納維諾;西夫韋肽

高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療 (highly active antiretroviral therapy，HAART)顯著改善了人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)/艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)患者的生存狀態(tài)。其主要原因是聯(lián)用靶向病毒復(fù)制周期不同階段的抗病毒藥物可協(xié)同發(fā)揮更高的抗病毒效果;同時(shí)，減少了單品種藥物的使用劑量而降低了毒副作用與易發(fā)耐藥的問(wèn)題。目前，研發(fā)不同作用機(jī)制的抗病毒藥物聯(lián)用組合，已成為抗病毒藥物研究領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)。馬納維諾(maraviroc，MRV)是CC趨化因子受體5〔chemokine(C-C motif)receptor 5，CCR5〕的拮抗劑，可阻止HIV利用CCR5作為輔助受體進(jìn)入CD4+T細(xì)胞，是目前唯一批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的CCR5輔助受體拮抗劑，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)中均顯示出良好的抗病毒效果［1-3］。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院在全球組織協(xié)調(diào)了多中心臨床試驗(yàn)，對(duì)MRV與反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑如dapivirine(TMC120)、恩曲他濱(emtricitabine)及替諾福韋(tenofovir，TFV)的聯(lián)合抗病毒效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)［4］。西夫韋肽(sifuvirtide，SFT)為針對(duì)HIV包膜蛋白gp41的新一代膜融合抑制劑，在體外實(shí)驗(yàn)中顯示出良好的安全性、穩(wěn)定性及生物學(xué)活性［5］，且臨床試驗(yàn)Ⅱb期結(jié)果顯示，SFT結(jié)合HAART 24周后，可將59%的HIV感染者體內(nèi)病毒載量降至檢測(cè)線(xiàn)以下，并有效提升89%患者的CD4細(xì)胞數(shù)［6］。本研究對(duì)MRV與SFT在抗HIV感染中的協(xié)同作用效果進(jìn)行了評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 材料

MRV購(gòu)自上海百誼生物科技有限公司，SFT購(gòu)自天津扶素生物技術(shù)有限公司。子宮頸癌細(xì)胞系TZM-bl細(xì)胞為前期實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基、新生牛血清購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，噻唑藍(lán)(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，熒光素酶底物購(gòu)自美國(guó)Promega公司。Synergy 2多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司，Victor 3多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自德國(guó)PerkinElmer公司，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞存活率計(jì)算采用高于實(shí)驗(yàn)中2種藥物使用的最高濃度來(lái)進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。單用SFT和MRV的濃度分別為40 nmol/L和50 nmol/L，聯(lián)用濃度為20 nmol/L(SFT)和50 nmol/L(MRV)。將對(duì)應(yīng)濃度的藥物加入96孔板中，每孔加入1×104個(gè)TZM-bl細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h;每孔加入20 μl 10%MTT液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育3～4 h;吸去上清液，每孔加入200 μl二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，振蕩10 min后在490 nm 處讀取光密度(optical density，OD)，存活率 =(OD實(shí)驗(yàn)組-OD本底)/(OD陽(yáng)性對(duì)照-OD本底)×100%，數(shù)據(jù)以mean±SD表示。

1.3.2 體外單用SFT和MRV抑制HIV感染采用3種HIV包膜假病毒SVPB16、SVPC12及CRF01 _AE進(jìn)行體外抗病毒實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)孔中分別加入SFT和MRV，將SFT和MRV進(jìn)行3倍倍比稀釋?zhuān)琒FT初始濃度為33.7 nmol/L，MRV初始濃度為41.7 nmol/L(SVPC12和CRF01_AE)和125 nmol/ L(SVPB16)，共8個(gè)稀釋度。將TZM-bl細(xì)胞按1 ×104個(gè)/孔加入96孔板中，每孔分別按100倍半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(50%tissue culture infective dose，TCID50)加入3種不同假病毒。同時(shí)設(shè)只有細(xì)胞的空白對(duì)照孔及加入細(xì)胞和假病毒的陽(yáng)性對(duì)照孔。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h;吸去上清液，每孔加入30 μl裂解液，振蕩器振蕩10 min;加入50 μl熒光素酶底物，置化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀中，用BrighGlo程序讀取發(fā)光值。抑制病毒感染率=(陽(yáng)性對(duì)照熒光值-實(shí)驗(yàn)孔熒光值)/(陽(yáng)性對(duì)照熒光值 -空白對(duì)照熒光值)×100%。最后用CalcuSyn軟件計(jì)算每種化合物的半數(shù)有效濃度(50%effective concentration，EC50)。

1.3.3 體外聯(lián)用SFT與MRV抑制HIV感染抑制HIV假病毒SVPB16的SFT與MRV聯(lián)用濃度比為3∶1，SFT起始濃度為12 nmol/L;抑制SVPC12的濃度比為5∶7，SFT起始濃度為5 nmol/L;抑制CRF01_AE的濃度比為7∶5，SFT起始濃度為14 nmol/L。將2種藥物按對(duì)應(yīng)濃度混合后進(jìn)行3倍倍比稀釋?zhuān)还?個(gè)稀釋度。每孔加入100 TCID50的假病毒及1×104個(gè)TZM-bl細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h;吸去上清液，每孔加入30 μl裂解液，振蕩器振蕩10 min;加入50 μl熒光素酶底物，置化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀中，用BrighGlo程序讀取發(fā)光值。

1.3.4 協(xié)同效果的分析聯(lián)用SFT與MRV的協(xié)同效應(yīng)可根據(jù)等效線(xiàn)法判斷。該方法以劑量為導(dǎo)向，等效線(xiàn)法的坐標(biāo)軸表示每種藥物的劑量，X軸和Y軸所選劑量與每種藥物所能產(chǎn)生的抑制率(Fa值)相對(duì)應(yīng)。直線(xiàn)(圖中斜邊)連接X(jué)軸與Y軸上能產(chǎn)生相同F(xiàn)a值的相應(yīng)劑量，如果聯(lián)合用藥的點(diǎn)落在直線(xiàn)上，那么這一Fa處效應(yīng)為相加;如果落在斜邊左下方，這一Fa處效應(yīng)為協(xié)同;如果落在右上方，那么這一Fa處效應(yīng)為拮抗。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

如圖1所示，SFT和MRV不管是單用還是聯(lián)用，均能保證TZM-bl的存活率在95%以上。單用40 nmol/L SFT時(shí)細(xì)胞存活率為(96.7±0.1)%，單用50 nmol/L MRV時(shí)細(xì)胞存活率為(96.8± 0.2)%，聯(lián)用后細(xì)胞存活率為(96.4±0.1)%。

2.2 體外單用SFT和MRV抑制HIV感染的評(píng)價(jià)

如表1所示，當(dāng)單用時(shí)，SFT和MRV的EC50分別為0.91［0.66，1.26］、4.84［3.65，6.41］nmol/L (SVPB16);0.18［0.09，0.33］、0.47［0.27，0.82］nmol/L(SVPC12);0.71［0.57，0.87］、0.45［0.24， 0.84］nmol/L(CRF01_AE)。

圖1 SFT和MRV單用或聯(lián)用后TZM-bl細(xì)胞的存活率Fig.1 The cytotoxicity of sifuvirtide and maraviroc，alone or combined，in TZM-bl cells

表1 SFT和MRV單用時(shí)的EC50Tab.1 The EC50of sifuvirtide and maraviroc using alone

2.3 體外聯(lián)用SFT與MRV抑制HIV感染的評(píng)價(jià)

從劑量-效應(yīng)曲線(xiàn)可看出，SFT與MRV聯(lián)用可使有效劑量減少(圖2)。感染SVPB16包膜假病毒時(shí)，與單用SFT比較，聯(lián)用后EC50降低1倍(0.45 nmol/L vs.0.91 nmol/L)，表明SFT與MRV聯(lián)用強(qiáng)于SFT單用。相對(duì)應(yīng)，聯(lián)用后MRV的EC50降低2倍 (1.52nmol/L vs.4.84nmol/L)。對(duì)于SVPC12包膜假病毒，SFT和MRV的EC50分別降低1倍和3倍;而對(duì)于CRF01_AE假病毒，則分別降低4倍和3倍(表2)。

表2 SFT和MRV單用或聯(lián)用時(shí)的EC50Tab.2 The EC50ofsifuvirtide maraviroc， alone or combined

圖2 SFT和MRV單用或聯(lián)用抑制假病毒感染的效果Fig.2 The antiviral activity of sifuvirtide and maraviroc，alone or combined

2.4 體外聯(lián)用SFT與MRV的協(xié)同分析

采用Fa-聯(lián)合指數(shù)(combined index，CI)曲線(xiàn)法和等效線(xiàn)法判斷SFT與MRV聯(lián)用的協(xié)同效果。如表3所示，在聯(lián)用SFT與MRV后抑制率達(dá)50%、75%及90%時(shí)，計(jì)算CI值，3種假病毒的CI值均＜1。在等效線(xiàn)法中同樣可觀察到，在抑制率達(dá)50%、75%及90%時(shí)，聯(lián)合用藥的點(diǎn)全部落在直線(xiàn)的下方。2種方法均證明，對(duì) SVPB16、SVPC12及CRF01_AE這3種假病毒，SFT與MRV聯(lián)用具有很好的協(xié)同作用。

表3 不同抑制率下SFT和MRV的CI值Tab.3 The CI value of sifuvirtide and maraviroc at different inhibition ratio

圖3 等效線(xiàn)法對(duì)SFT與MRV聯(lián)用結(jié)果的分析Fig.3 The synergistic effect of sifuvirtide and maraviroc

3 討論

性途徑傳播已成為HIV-1傳播的主要途徑，殺微生物制劑在控制AIDS患者、HIV感染者經(jīng)性傳播中越來(lái)越受重視［7-9］。目前，一些抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物作為抗HIV藥物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，但由于藥物毒性、耐藥性及高昂費(fèi)用等原因，單用這些藥物受到一定限制［10-13］。相關(guān)研究表明，當(dāng)聯(lián)用2種或多種抗HIV藥物時(shí)，可達(dá)到更好抑制HIV-1傳播的目的［14，15］。聯(lián)用比單用不但達(dá)到更好的保護(hù)效果，而且每種藥物的使用濃度明顯降低，表明藥物之間具有較好的協(xié)同作用［16］。MRV與反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(如替諾福韋)聯(lián)用就顯示出了較好的協(xié)同作用［4］。MRV與SFT作為趨化因子拮抗劑和膜融合抑制劑，臨床使用效果很好，但兩者聯(lián)用能否在藥物用量及抑制效果方面有明顯改善尚不明確，因此本課題組探索了聯(lián)用MRV與SFT體外抗病毒感染的協(xié)同作用。結(jié)果顯示，針對(duì)SVPB16、SVPC12和CRF01_ AE這3種HIV假病毒，當(dāng)抑制率達(dá)50%時(shí)藥物聯(lián)用濃度均低于單用濃度，且表現(xiàn)出協(xié)同作用。其中對(duì)SVPB16假病毒的抑制率達(dá)50%時(shí)，聯(lián)用濃度比單用濃度分別降低了2倍(MRV)和1倍(SFT)。藥物使用濃度降低一方面降低成本，為后續(xù)推廣提供方便;另一方面降低藥物毒副作用，提高安全性。本研究中細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果表明，MRV與SFT的應(yīng)用不會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成明顯影響，抑制病毒感染的結(jié)果為藥物的實(shí)際抑制效果。綜上所述，體外聯(lián)用MRV與SFT具有較好的協(xié)同作用，能提高抗HIV效果，為以后藥物聯(lián)用提供了理論支持。

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Evaluation of anti-human immunodeficiency virus activity of maraviroc combined with sifuvirtide in vitro

BEN Yin-Yin*，ZHU Jing-Yu*，XU Jian-Qing，ZHANG Xiao-Yan
Shanghai Public Health Clinical Center，Shanghai 201508，China

The present paper aims to explore the synergistic effect of maraviroc(MRV)［an inhibitor of human immunodeficiency virus type 1(HIV-1)co-receptor chemokine(C-C motif)receptor 5(CCR5)］and sifuvirtide (SFT)(HIV-1 entry inhibitor)on HIV infection.Three HIV-1 pseudovirus strains including SVPB16，SVPC12 and CRF01_AE subtypes were used to infect TZM-bl cells in vitro.The effects of MRV and SFT，alone or combined，on the HIV-1/TZM-bl infection system were investigated，and their 50% effective concentration (EC50)values were calculated.The synergistic effect of SFT and MRV was predicted by CalcuSyn software according to the combined index(CI)values.The CI values indicated a synergistic effect when ＜1，an antagonistic effect when＞1，and an additive effect when equal to 1.The cytotoxic effects of MRV and SFT，alone or combined，were also evaluated by methylthiazolyl tetrazolium(MTT)method.When used alone，the EC50values of SFT were 0.91，0.17 and 0.71 nmol/L against SVPB16，SVPC12 and CRF01_AE pseudoviruses，respectively;and the EC50values of MRV were 4.84，0.47 and 0.45 nmol/L，respectively.When SFT and MRV were used in combination，the EC50values of them were reduced by two to four times for SFT(0.45，0.09 and 0.15 nmol/L)，and two to three times for MRV(1.52，0.12 and 0.11 nmol/L).The results calculated by isobologram software indicated that there was a good synergistic effect between SFT and MRV.It is suggested that combination of SFT and MRV has a good synergistic effect on HIV-1 infection in vitro with no significant cell toxicity.

Human immunodeficiency virus; Synergistic effect; 50% effective concentration; Maraviroc;Sifuvirtide

.ZHANG Xiao-Yan，E-mail:zhangxy066@gmail.com*同為第一作者

2014-10-18)

“十二五”國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2013ZX10001006)

張曉燕