康耀月，郭紅英，張詠梅，張繼明

1.復旦大學附屬華山醫(yī)院感染科，上海200040;2.上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 200083

乙型肝炎病毒表面抗原T131N/M133T變異株糖基化和抗原性研究

康耀月1，郭紅英2，張詠梅1，張繼明1

1.復旦大學附屬華山醫(yī)院感染科，上海200040;2.上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 200083

為探討乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)T131N/M133T變異株的糖基化和抗原性，本研究構(gòu)建了T131N/M133T變異的HBsAg過表達質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，用蛋白免疫印跡法檢測HBsAg表達和糖基化情況，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和免疫熒光法檢測HBsAg的抗原性。結(jié)果顯示，T131N/M133T變異使HBsAg產(chǎn)生了新的N-糖基化修飾，該變異質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)HBsAg水平顯著低于野生型，上清液中HBsAg水平也有一定程度降低。結(jié)果提示，T131N/M133T變異使HBsAg發(fā)生了新的N-糖基化修飾，該變異產(chǎn)生的糖基化可能影響HBsAg的胞內(nèi)穩(wěn)定性，對HBsAg的抗原性也有一定影響。

乙型肝炎病毒表面抗原;T131N/M133T;糖基化;抗原性

乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)包膜蛋白的主要成分，由226個氨基酸組成，其中第124～147位氨基酸被稱為“a”抗原決定簇，是抗體中和的主要位點。該區(qū)域內(nèi)氨基酸變異往往會影響HBsAg的抗原性或免疫原性。其中報道較多的是HBsAg的G145R變異(145位氨基酸由甘氨酸G變異為精氨酸R)，該變異使HBsAg抗原性降低，導致HBV疫苗免疫失敗或免疫球蛋白治療無效［1-4］。氨基酸變異為天冬氨酸N的情況也較多見。HBsAg的T123N變異在1例接受乙型肝炎免疫球蛋白治療的肝移植患者中發(fā)現(xiàn)［5］，該變異降低了HBsAg的抗原性［6，7］。T123N變異后產(chǎn)生N-X-S/T(天冬酰胺-除脯氨酸以外的任意氨基酸-絲氨酸/蘇氨酸)序列，這是一種經(jīng)典的N-糖基化位點［8-11］，該位點產(chǎn)生的HBsAg糖基化修飾可能降低其抗原性［12］，從而影響HBsAg檢測。本課題組曾在臨床上收集到1例低水平HBsAg慢性乙型肝炎患者的血清，分離HBV后對其S區(qū)基因進行測序發(fā)現(xiàn)多種變異，其中T131N和M133T聯(lián)合變異(T131N/M133T)產(chǎn)生了N-X-S/T序列。因此，本研究在已知序列的HBV野生株基礎上，通過定點誘變技術(shù)構(gòu)建T131N/M133T變異株，研究其對HBsAg糖基化及抗原性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和細胞系HBV野生型全基因質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建，pXF3H質(zhì)粒為德國Essen大學陸蒙吉教授饋贈，Huh7細胞和HeLa細胞由本實驗室保藏，DH5α感受態(tài)細胞購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 試劑構(gòu)建質(zhì)粒過程中的內(nèi)切酶EcoRⅠ、PstⅠ及連接酶T4均購自美國NEB公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，蛋白免疫印跡和免疫熒光所用anti-HA單克隆抗體(簡稱單抗)購自美國CST公司，免疫熒光所用anti-S1單抗由中國科學院武漢病毒研究所提供，Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 488及Hochest 33258抗體均購自美國Invitrogen公司。

表1 構(gòu)建質(zhì)粒所需引物序列Tab.1 Primers for the construction of the expression vectors

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒 pHBsAg-WT、pHBsAg-T131N/M133T及pHBsAg-T123N在野生型全基因質(zhì)粒536207(GenBank登錄號:AY220698)基礎上，通過SP1/SP2(表1)擴增S基因，然后通過PstⅠ和EcoRⅠ雙酶切將S基因連接到載體pXF3H上，構(gòu)建HBsAg真核表達載體，命名為 pHBsAg-WT［6］。通過定點誘變和誘變引物T131NM133TF、T131NM133T-R及T123N-F、T123N-R(表1)，獲得包含單個變異位點T131N/M133T和T123N的質(zhì)粒，分別命名為 pHBsAg-T131N/M133T和pHBsAg-T123N。

1.2.2 蛋白免疫印跡法檢測HBsAg表達Huh7細胞按常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清(Gibco公司)和抗生素，青霉素終濃度為100 U/ml，鏈霉素終濃度為100 μg/ml。細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.125%胰酶消化傳代。轉(zhuǎn)染前1 d，在6孔板上每孔接種2×105個細胞。用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將 pHBsAg-WT、pHBsAg-T131N/M133T和pHBsAg-T123N質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Huh7細胞，每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒1.5 μg，空載體質(zhì)粒作為對照同時轉(zhuǎn)染細胞。取30 μl細胞上清液和含30 μg蛋白的細胞裂解液，分別加 Loading Buffer，煮沸變性10 min，行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜，封閉，與anti-HA單抗孵育，以β-actin為內(nèi)參，4℃孵育過夜。次日洗膜，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記抗體，室溫孵育1 h后用化學發(fā)光液顯影。另取2等份含30 μg蛋白的細胞裂解液，分別加入G7、NP40、PNGase F，以及G5、Endo H，37℃消化過夜，用anti-HA單抗行蛋白免疫印跡檢測。同法，將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，在轉(zhuǎn)染后6 h每孔加入N-糖基化抑制劑衣霉素(tunicamycin)，轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞裂解液，取30 μg行蛋白免疫印跡檢測，以Fermentas預染蛋白Marker SM0671為標記。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測HBsAg在細胞上清液中的水平質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細胞48 h后收集細胞上清液，取600 μl送上海艾迪康醫(yī)學檢驗中心用美國雅培ARCHITECT進行HBsAg定量檢測。另取一定量的細胞上清液稀釋10倍后，分別用科華生物HBsAg酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 試 驗 (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒及中國科學院武漢病毒研究所單抗室制備的3種抗HBsAg單抗S1、S11和A11包被的96孔板檢測HBsAg。按說明書操作，檢測結(jié)果用樣品的光密度(optical density，OD)值與陰性對照 OD值的比值(S/N)表示。

1.2.4 免疫熒光檢測HBsAg的表達和分布同1.2.2方法，將各種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細胞，48 h后收集細胞，用含3.5%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)室溫固定15 min;然后用含5%正常山羊血清(normal goat serum，NGS)和0.5%Triton X-100的PBS在室溫下透化并封閉1 h，依次孵育2種一抗(anti-HA單抗、anti-HBsAg S1單抗)及 2種二抗(Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 488);最后用Hochest 33258染核后在熒光顯微鏡下觀察HBsAg的表達和分布。

2 結(jié)果

2.1pHBsAg-WT、 pHBsAg-T131N/M133T 和pHBsAg-T123N質(zhì)粒的構(gòu)建

pHBsAg-WT過表達質(zhì)粒及在其基礎上誘變的pHBsAg-T131N/M133T、pHBsAg-T123N質(zhì)粒經(jīng)上海博尚生物技術(shù)有限公司測序正確，且未引起S基因其他位點突變，證實質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 HBsAg在細胞內(nèi)的表達及細胞上清液中的分泌

野生型和變異型質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Huh7細胞48 h后，分別收集細胞上清液(圖1A)和細胞裂解液(圖1B)。蛋白免疫印跡檢測結(jié)果顯示，細胞上清液和細胞裂解液中野生型質(zhì)粒表達產(chǎn)生相對分子質(zhì)量為26 000和29 000的HBsAg條帶，分別代表HBsAg的非糖基化和糖基化形式［12］。T131N/M133T和T123N變異質(zhì)粒表達產(chǎn)生26 000、29 000及32 000的HBsAg條帶。經(jīng)糖苷酶抑制劑衣霉素(圖1C)及2種N-糖苷水解酶PNGase F(圖1D)、Endo H(圖1E)處理后，野生型與變異型質(zhì)粒的29 000和32 000條帶均消失，證實T131N/M133T變異產(chǎn)生了新的N-糖基化。另外，未經(jīng)衣霉素處理的T131N/M133T使細胞內(nèi)HBsAg水平顯著低于野生型和T123N變異型質(zhì)粒;而經(jīng)衣霉素處理后，三者無顯著差異(圖1)。

圖1 HBsAg在細胞內(nèi)及細胞上清液中的表達和分泌Fig.1 Expression of HBsAg in transfected Huh7 cells and culture supernatants

2.3 細胞上清液中HBsAg水平

ELISA試劑盒(圖2A)、3種抗HBsAg單抗(圖2B)及雅培ARCHITECT(圖2C)的HBsAg定量檢測顯示，T123N變異型用3種抗HBsAg單抗S1、S11和A11檢測的結(jié)果明顯低于野生型，與既往報道一致［12］;T131N/M133T變異型用3種抗HBsAg單抗和雅培 ARCHITECT檢測的結(jié)果略低于野生型。

圖2 ELISA檢測細胞上清液中HBsAg水平Fig.2 Reactivity of expressed wild-type HBsAg and mt-HBsAg to a commercial ELISA kit or to mAbs or to the ARCHITECT assay

2.4 細胞內(nèi)HBsAg的表達和分布

anti-HA熒光染色結(jié)果顯示，T131N/M133T變異質(zhì)粒的熒光強度較野生型和T123N變異型弱。另外，野生型質(zhì)粒的熒光主要呈胞質(zhì)內(nèi)均勻分布，而T131N/M133T呈核周聚集分布。T131N/M133T變異質(zhì)粒用anti-S1與anti-HA抗體熒光染色的強度無顯著差異(圖3)。

圖3 HA單抗和HBsAg-S1單抗免疫熒光染色結(jié)果(× 1 000)Fig.3 Immunofluorescence staining of wt-and mt-HBsAg with anti-HA mAb and anti-S1 mAb(×1 000)

3 討論

本研究構(gòu)建了HBsAg的T131N/M133T變異過表達質(zhì)粒，同時將T123N質(zhì)粒作為陽性參照，研究HBsAg的T131N/M133T變異產(chǎn)生的糖基化對其抗原性的影響。

野生型HBsAg有非糖基化的26 000及糖基化的29 000形式［7，13］。T131N/M133T變異后，HBsAg產(chǎn)生了32 000的新糖基化形式。經(jīng)糖苷酶抑制劑和2種N-糖苷水解酶處理后，32 000的蛋白條帶消失，證實這種新的糖基化形式為N-糖基化。在B和C型HBV序列中，必須同時存在T131N和M133T雙突變才能產(chǎn)生N-X-S/T糖基化位點;而在其他基因型HBV序列中，天然存在T131N位點，只需M133T單突變即可產(chǎn)生N-X-S/T糖基化位點。在后續(xù)研究中將進一步構(gòu)建T131N和(或)M133T單突變作為對照，理論上這2個單突變不會產(chǎn)生新的糖基化修飾。

蛋白免疫印跡檢測顯示，未經(jīng)糖苷酶抑制劑處理組T131N/M133T使細胞內(nèi)HBsAg水平顯著低于野生型和T123N突變型，與免疫熒光法檢測結(jié)果一致:HA和S1抗體檢測均顯示T131M/M133T的熒光強度比野生型和T123N變異型弱。另一方面，經(jīng)糖苷酶抑制劑處理后，三者表達沒有差異。結(jié)果提示，T131N/M133T變異可能影響HBsAg穩(wěn)定性或促進其分泌，但分泌到上清液中的HBsAg水平在T131N/M133T變異型、野生型與T123N變異型之間沒有很大差異，表明T131N/M133T變異可能影響了糖基化HBsAg的胞內(nèi)穩(wěn)定性。這個推斷與該臨床變異株HBsAg水平低的現(xiàn)象一致。既往有研究報道糖基化狀態(tài)改變會降低蛋白的穩(wěn)定性［14］。

近期研究指出，HBsAg發(fā)生糖基化變異后其抗原性降低［12］。本研究中，采用敏感度較高的HBsAg ELISA試劑盒、特異度較高的3種抗HBsAg單抗及雅培 ARCHITECT對野生型和 T131N/ M133T變異型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞上清液中HBsAg水平進行檢測，結(jié)果提示上清液中HBsAg水平雖無顯著差異，但仍有一定程度降低。因此，HBsAg的T131N/M133T變異產(chǎn)生的糖基化使其抗原性降低，從而影響檢測，與該臨床變異株HBsAg水平低的現(xiàn)象一致。

糖基化對蛋白功能具有重要意義。已知免疫系統(tǒng)中幾乎所有關(guān)鍵因子均為糖蛋白［15］。HBsAg“a”抗原決定簇內(nèi)的N-糖基化變異可引起HBV免疫逃逸，從而使變異株在人群中水平傳播［16］。本研究中，T131N/M133T變異使HBsAg產(chǎn)生N-糖基化，使其抗原性降低，但對其免疫原性的影響尚有待進一步研究。

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Effects of T131N/M133T substitutions in hepatitis B virus surface antigen on glycosylation and antigenicity

KANG Yao-Yue1，GUO Hong-Ying2，ZHANG Yong-Mei1，ZHANG Ji-Ming1
1.Department of InfectiousDiseases，Huashan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200040，China;
2.Shanghai Public Health Clinic Center，Shanghai 200083，China

To study the impact of T131N/M133T substitutions in hepatitis B virus surface antigen(HBsAg)，the proteins expressed in Huh7 and HeLa cells were subjected to Western blotting，enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)and immunofluorescence(IF)staining.The results showed that T131N/M133T substitutions created a new site for N-glycosylation.The detected level of T131N/M133T was significantly low，indicating a potential negative impact on stability and antigenicity of HBsAg.

Hepatitis B virus surface antigen;T131N/M133T;Glycosylation;Antigenicity

.ZHANG Ji-Ming，E-mail:jmzhang@fudan.edu.cn

2015-01-15)

國家自然科學基金(81271833)，“十二五”國家科技重大專項(2013ZX10002001、2012ZX10002007-001-002)，國家重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(2012ZX09303004-001)

張繼明