賀希文，高彩霞，姜騫，權(quán)金強，蔡原*，曲連東*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，哈爾濱 150001)

研究報告

加系SPF大白豬和長白豬群體遺傳學(xué)分析

賀希文1，2，高彩霞2，姜騫2，權(quán)金強1，蔡原1*，曲連東2*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，哈爾濱 150001)

目的研究中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所從加拿大引進(jìn)的SPF大白豬和長白豬的遺傳學(xué)背景。方法實驗采用19對微衛(wèi)星引物對該群體進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析。結(jié)果19個位點在大白豬群中檢測到84個等位基因，長白豬群中檢測到89個等位基因。大白豬的平均多態(tài)信息含量和平均雜合度分別為0.5271和0.5877；長白豬的平均多態(tài)信息含量和平均雜合度分別為0.5652和0.6066。由于S0155、S0143、S0178、Sw857和Sw936位點內(nèi)等位基因大小和含量差異顯著（P＜0.01)可作為大白豬和長白豬品種鑒定的候選位點。F-統(tǒng)計和遷移率分析結(jié)果表明，群體內(nèi)的分化較小，遺傳結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。結(jié)論引進(jìn)加系SPF純種大白豬和長白豬的遺傳結(jié)構(gòu)與國內(nèi)部分純種大白豬和長白豬相比更為穩(wěn)定，可作為實驗動物模型應(yīng)用于動物醫(yī)學(xué)和科學(xué)研究。

SPF豬；微衛(wèi)星標(biāo)記；實驗動物；遺傳多樣性

當(dāng)今世界大白豬和長白豬是最重要的商業(yè)品系肉用豬，尤其以生長速度快、繁殖力高、適應(yīng)性強和瘦肉率高的特點而被人們所熟知，它是世界上最著名，分布最廣的主導(dǎo)瘦肉型豬，全世界范圍內(nèi)均有飼養(yǎng)[1-3］。據(jù)調(diào)查，國內(nèi)外很多特有小型豬，如廣西巴馬小型豬、西藏小型豬、甘肅蕨麻豬、Yucatan小型豬等，作為實驗動物模型廣泛應(yīng)用于動物醫(yī)學(xué)、科學(xué)研究、器官移植等諸多方面[4-7］；而長白豬，杜洛克和大白豬等為重要的肉用型品種多用于經(jīng)濟性狀的選育和保種[8］，用于SPF級實驗動物模型研究更是鮮有報道。而中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所從加拿大引進(jìn)100頭無豬瘟、豬呼吸綜合征、豬傳染性胃腸炎、豬流感等病原體的SPF豬主要應(yīng)用于實驗動物，其中大白豬和長白豬各50頭包含32窩大白豬和28窩長白豬。隨豬附贈系譜材料顯示該種群可追溯至其10代以內(nèi)的血緣關(guān)系，引進(jìn)之后繼續(xù)對它們進(jìn)行封閉環(huán)境飼養(yǎng)，已繁育一代。運用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)檢測兩個種群的遺傳多樣性明確其遺傳背景為實驗動物化提供理論依據(jù)。現(xiàn)擬向哈爾濱市及周邊多個豬場、科研機構(gòu)和生物制藥物企業(yè)提供標(biāo)準(zhǔn)的實驗動物素材為豬病的研究和疫苗的制備提供良好的實驗動物材料。

微衛(wèi)星標(biāo)記（microsatellite)，又稱為短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeats，STRs)或簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSRs)，由2-6個核苷酸串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成，由于重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)在個體和品種間呈高度變異而產(chǎn)生數(shù)量豐富的等位基因（或基因型)，廣泛應(yīng)用于動植物優(yōu)良性狀的選育和標(biāo)記，如稻米的淀粉品質(zhì)、豬的主要經(jīng)濟性狀的選育與標(biāo)記[9-11］。在家畜育種和親子鑒定（包括個體來源、品種來源、個體或品種間的親緣關(guān)系鑒定)[12-14］中有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

98份豬耳組織樣本，引自加拿大，均來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所牧場。其中大白豬和長白豬各49頭，所采耳組織樣品均置于無菌的1.5 mL EP管中帶回實驗室，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗試劑

2×Taq PCR Starmix聚合酶購自GenStar，小劑量基因組DNA提取試劑盒購自Axygen公司。引物根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO)和國際動物遺傳學(xué)會（ISAG)聯(lián)合推薦的30對微衛(wèi)星引物中，依據(jù)等位基因數(shù)的豐富程度、分布在不同染色體的原則，選取了其中的19個微衛(wèi)星位點，實際實驗擴增過程中部分位點的退火溫度和擴增后分析范圍進(jìn)行微調(diào)（見表1)，由北京金唯智公司合成，其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.3 基因組DNA的提取

按照Axygen小劑量基因組DNA提取試劑盒說明書提取豬耳組織基因組DNA。將DNA溶于去離子水，用NanoDrop-100紫外分光光度計測定濃度和純度，然后用去離子水稀釋至 20 ng/μL，置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴增與檢驗

根據(jù)擴增片段的理論值大小，每組位點中的片段大小相差至少10～25 bp，并且標(biāo)記的熒光顏色不發(fā)生重疊，將19對微衛(wèi)星引物分為6組。PCR反應(yīng)體系為20μL:上、下游引物各1μL（10 mmol/L)，2 ×Taq PCR Starmix聚合酶10μL，模板DNA 1μL，ddH2O 7μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃～65℃退火（分組及不同引物的Tm值見表1)30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸7 min，10℃保存。擴增產(chǎn)物按組混合加樣進(jìn)行凝膠毛細(xì)管電泳檢驗，并用GeneMapper V4.0軟件進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)提取、分子量標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定和PCR產(chǎn)物片段大小的計算，最后根據(jù)核心堿基數(shù)完成基因型的判定。

1.5 統(tǒng)計分析

采用Excel Microsatellite Toolkit V3.1軟件，計算大白豬和長白豬在19個微衛(wèi)星位點上的等位基因數(shù)、雜合度、多態(tài)信息含量。利用Genepop V1.2軟件進(jìn)行群體間的遺傳分化和基因型差異的分析[15］。利用FSTAT V2.9.3進(jìn)行F-檢驗[16］。利用Structure V2.3軟件分析大白豬和長白豬的遺傳分化結(jié)構(gòu)圖，所設(shè)參數(shù)“Burnin Period”和“After Burnin”均為50 000次，K值為2-5，然后利用distructure軟件顯示圖形。

表1 19對微衛(wèi)星引物詳細(xì)信息Tab.1 Detailed information of the 19 microsatellite loci primers

2 結(jié)果

2.1 擴增結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠檢測，擴增片段大小與預(yù)期結(jié)果相符（圖1)。大白豬和長白豬在19個微衛(wèi)星位點分別檢測到84和89個等位基因，兩群體共享57個等位基因，平均含有4.42和4.63個等位基因（表2)。19個位點中S0005位點等位基因最多有14個，Sw2406和S0218位點等位基因最少各3個（表3)。

2.2 等位基因和雜合度分析

19個微衛(wèi)星位點的平均雜合度相對較高，其中長白豬略高于大白豬分別為0.6066和0.5877，均在0.5～0.7之間（表2)。大白豬群中S0005位點的雜合度最高為0.8395檢測到雜合體43個，S0178位點的雜合度最低為 0.1515僅檢測到 8個。Sw2406位點共檢測到221、233、251 bp 3個等位基因，而251 bp等位基因僅存在于大白豬群中，在長白豬群中并沒有檢測到該等位基因，表明251 bp等位基因為大白豬特有的等位基因；長白豬S0178位點的雜合度最高為0.7570，S0218位點的雜合度最低為0.0204，在S0218位點僅檢測到167 bp和169 bp兩個等位基因而169 bp等位基因在長白豬群中只檢測到一個。此外，Sw857 144 bp、Sw936 117 bp、S0143 168 bp、S0155 152 bp和S0178 109 bp這5個位點在兩群體間的分布和含量差異極顯著。結(jié)果表明相同位點的等位基因個數(shù)和雜合度在不同群體差異極顯著。

表2 大白豬和長白豬兩個群體在19個微衛(wèi)星位點上的雜合度和多態(tài)信息含量Tab.2 Value of heterozygosities and polymorphism information content（PIC)in the pedigree Yorkshire and Landrace populations at19 microsatellite loci

圖1 S0143位點擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification of the products of S0143 in agarose

2.3 多態(tài)信息含量

兩個群體中S0005位點的多態(tài)信息含量最高為0.8102，S0178位點多態(tài)信息含量最低0.1387，大白豬和長白豬的平均多態(tài)信息含量分別為0.5271和0.5652。S0005、S0218、S0068、Sw2410、S0097、Sw122、Sw2406、S0355位點的多態(tài)信息含量在大白豬群普遍高于長白豬群，而其他11個位點則反之（表2)。19個微衛(wèi)星位點中S0005位點的多態(tài)性信息含量最高為0.8696，Sw2406位點多態(tài)信息含量最低為0.3328，平均多態(tài)信息含量為0.6388（表3)。結(jié)果表明大白豬和長白豬兩個群體間的平均多態(tài)信息含量差異無顯著性（P＞0.05)，沒有表現(xiàn)直接的線性關(guān)系。

2.4 F-統(tǒng)計和遺傳結(jié)構(gòu)分析

通過微衛(wèi)星座位的F-統(tǒng)計以及Nm來檢驗群體間的遺傳分化程度和遷移率（表3)。群體的固定指數(shù)Fst為0.0273-0.5218，均值為0.2145，而Fis和Fit指數(shù)有正有負(fù)，如 S0178、S0218、IGF1、S0228、S0355、Sw1067位點的Fis值均為正值，而Fit除了SOO68為負(fù)值外其他18個位點均為正值。Fis和Fit出現(xiàn)正值表明群體基因型分化顯著。Nm為0.2291-8.9075，平均值為1.5320。Nm越小表明群體的遺傳結(jié)構(gòu)越相似。群體遺傳結(jié)構(gòu)分析表明，兩豬群遺傳分化結(jié)構(gòu)穩(wěn)定（圖2)，一方面可能因為它們是純系品種，另一方面則主要是因為兩豬群在19個位點的等位基因較少，共享極為有限的等位基因。

表3 19個微衛(wèi)星座位的雜合度，多態(tài)信息含量和F-統(tǒng)計Tab.3 The F-statistics and polymorphism information content（PIC)of the 19 microsatellite loci

圖2 大白豬和長白豬的遺傳結(jié)構(gòu)Fig.2 Genetic structure of Yorkshire and Landrace pigs

3 討論

3.1 群體的多樣性

微衛(wèi)星標(biāo)記以其分析方法便捷、操作簡單等優(yōu)點，在親子鑒定、輔助標(biāo)記和群體遺傳多樣性等方面得到廣泛應(yīng)用。研究表明19個微衛(wèi)星位點之間的多樣性差異存在顯著性（P＞0.05)，主要表現(xiàn)在相同位點的等位基因頻率在大白豬和長白豬群體中的分布差異有顯著性（P＞0.05)，如在S0178位點109 bp的等位基因在大白豬種群出現(xiàn)的頻率最高，而長白豬種群在109 bp處等位基因僅檢測到3個。其中19個位點特異性等位基因出現(xiàn)在長白豬群的頻率較高。如S0178位點處121、123、125 bp等位基因，Sw936位點處117 bp等位基因，S0228位點處230和234 bp等位基因和S0155位點處152 bp等位基因僅在長白豬種群中被檢測到，而Sw857位點處144 bp和S0143位點處168 bp等位基因僅在大白豬被檢測到，可能與長白豬具有較高的雜合度有關(guān)?？蓪0155、S0143、S0178、Sw857和Sw936位點作為長白豬和大白品種鑒定的候選微衛(wèi)星位點。李何君等[17］和Costa等[18］分別應(yīng)用12和14對微衛(wèi)星引物對美系、英系、法系大約克夏豬群體和歐洲野豬進(jìn)行品系鑒定及個體鑒定，鑒定正確率均為100%，本研究選取的5對候選品種鑒定引物均在兩者的研究之列，說明該位點是準(zhǔn)確、有效、可靠的品系鑒定位點。此外，分別對大白豬和長白豬群體的觀測雜合度和期望雜合度進(jìn)行卡方檢驗，表明兩群體差異無顯著性（P＞0.05)，符合封閉群條件（參照實驗用小型豬遺傳質(zhì)量控制，北京地方標(biāo)準(zhǔn): DB11/T 828.3 2011)。可從分子水平明確兩種群的遺傳背景，反映出大白豬和長白豬兩群體之間的遺傳差異并作為“活的儀器”廣泛應(yīng)用于病毒的感染實驗，疫苗的檢定和評價，為遺傳保種和實驗動物化提供良好的分子基礎(chǔ)。

遺傳多樣性的衡量指標(biāo)通常為群體的平均雜合度和多態(tài)信息含量，大白豬的平均多態(tài)信息含量和平均雜合度分別為0.5271和0.5877；長白豬的平均多態(tài)信息含量和平均雜合度分別為0.5652和0.6066。大白豬和長白豬兩個品種的平均雜合度與平均多態(tài)信息含量與趙振華等[19］和鞏元芳等[20］對國內(nèi)大白豬和長白豬的研究結(jié)果相比較低，表明該種群與國內(nèi)純系品種相比人工選育的程度更高，遺傳結(jié)構(gòu)更趨穩(wěn)定。此外，19個微衛(wèi)星座位的平均雜合度比Li等[21］對臺灣歐洲純系品種豬的研究結(jié)果略高，表明它們的選育程度非常接近，遺傳結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，更適合選用于標(biāo)準(zhǔn)的實驗動物材料。

3.2 群體的遺傳分化與變異

Fis值和Fit值均有正有負(fù)，表明群體的等位基因和基因型分化顯著，主要表現(xiàn)為相同位點的等位基因在不同品種間的分布差異顯著（P＞0.01)。而Fst值表示群體間的分化程度，F(xiàn)st的平均值為0.2145與趙振華等[19］和楊彤彤等[22］相比此次引進(jìn)種群的分化程度顯著（P＞0.01)低于國內(nèi)部分純種豬群[15］。Nm值越小表示群體間的遺傳結(jié)構(gòu)越相似，Nm的平均值為1.5320也顯著（P＞0.01)低于楊彤彤等[22］對我國部分純系豬的研究。與國內(nèi)部分保存的純系豬相比又一次證明了中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所引進(jìn)的大白豬和長白豬兩純系種群群體內(nèi)分化較小遺傳結(jié)構(gòu)穩(wěn)定適合用于實驗動物材料，這可能與該種群的長期人工選育有關(guān)。

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Analjsis of the pedigreed population genetics of SPF Yorkshire and Landrace pigs im ported from Canada

HE Xi-wen1，2，GAO Cai-xia2，JIANG Qian2，QUAN Jin-qiang1，CAIYuan1*，QU Lian-dong2*
（1.College of Animal Science and Technology of Gansu Agriculture University，Lanzhou 730070，China. 2.State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences（CAAS)，Harbin 150001)

ObjectiveTo understand the genetic background of the specific pathogen-free Yorkshire and Landrace pigs，imported from Canada by Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences.MethodsThe population genetics were investigated by using 19 pairs ofmicrosatellite primers.ResultsIn the Yorkshire pigs and Landrace pigs，84 and 89 alleles，respectively，were detected at19 microsatellites loci.The average polymorphic information content and mean heterozygosity in the Yorkshire pigs were 0.5271 and 0.5877，and in the Landrace population were 0.5652 and 0.6066，respectively.Because of the significant（P＜0.01)differences of alleles in different loci such as S0155，S0143，S0178，Sw857 and Sw936，itmade them possible to be used to identify Yorkshire and Landrace pigs＇breed. F-statistics showed that the differentiation within the population was small and genetic structure was stable.ConclusionsCompare with the domestic pedigree largeWhite and Landrace pigs，the SPF pedigree pigs imported from Canada aremore stable in genetic structure，and can be used as laboratory animalmodels in animal science research.

Specific pathogen-free pigs；Microsatellite；Laboratory Animal；Genetic diversity

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0551-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.001

2015-09-28

國際科技合作計劃項目（2010DFB33620)；哈爾濱市青年科技創(chuàng)新人才專項資金項目（2013RFQYJ043)。

賀希文（1987-)，男，碩士研究生，專業(yè):動物遺傳育種與繁殖，E-mail:hexiwenso@163.com

蔡原，副教授，研究方向:動物遺傳育種與繁殖.E-mail:caiyuan@gsau.edu.cn

曲連東，研究員，研究方向:分子病毒學(xué)與動物疫病診斷學(xué).E-mail:qld@hvri.ac.cn