趙善民，肖邦，林麗芳，宮晨，王運(yùn)慧，程繼帥，余琛琳，叢薇，湯球，孫偉，崔淑芳

（第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，上海 200433)

研究報(bào)告

RNA干擾抑制Beclin1基因?qū)β泯B鼠成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的影響

趙善民，肖邦，林麗芳，宮晨，王運(yùn)慧，程繼帥，余琛琳，叢薇，湯球，孫偉，崔淑芳*

（第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，上海 200433)

目的應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制自噬調(diào)控基因Beclin 1的表達(dá)，檢測(cè)Beclin 1表達(dá)對(duì)裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的影響以及p53、BAX、Bcl2等基因表達(dá)的影響。方法分別檢測(cè)裸鼴鼠成纖維細(xì)胞經(jīng)饑餓、H2O2刺激等處理后Beclin 1的表達(dá)，然后采用設(shè)計(jì)的Beclin l基因的干擾RNA及陰性對(duì)照分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染裸鼴鼠成纖維細(xì)胞。采用real-time PCR及Western blot法檢測(cè)沉默效果后，采用CCK-1實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默后細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，然后采用Western blot檢測(cè)相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平。結(jié)果饑餓與H2O2刺激均能導(dǎo)致Beclin 1表達(dá)水平的改變。采用gene expresso轉(zhuǎn)染試劑對(duì)裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到90%以上，real-time PCR及Western blot結(jié)果顯示所設(shè)計(jì)的Beclin 1 siRNA可有效降低Beclin 1的表達(dá)。Beclin 1基因沉默后，裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于對(duì)照組，細(xì)胞早期凋亡與晚期凋亡率均顯著升高，同時(shí)p53、BAX、Bcl2、LC3B、p-AKT、mTOR等表達(dá)量下降。結(jié)論Beclin 1在裸鼴鼠成纖維細(xì)胞抵抗饑餓、H2O2刺激等過(guò)程中表達(dá)量顯著變化，同時(shí)抑制Beclin 1的表達(dá)，可抑制裸鼴鼠細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，這提示Beclin 1基因?qū)β泯B鼠自噬、增殖、凋亡起到調(diào)控作用。

裸鼴鼠；成纖維細(xì)胞；Beclin 1；RNA干擾；增殖；凋亡

裸鼴鼠是一種具備抗腫瘤、抗衰老、耐低氧等優(yōu)勢(shì)生物學(xué)特征的新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源，目前已被科學(xué)家應(yīng)用于腫瘤學(xué)、免疫學(xué)及心血管學(xué)等領(lǐng)域的研究[1-3］。研究表明裸鼴鼠在抗腫瘤方面具有多種特殊的分子信號(hào)機(jī)制抵抗細(xì)胞的過(guò)量增殖及腫瘤的產(chǎn)生，例如裸鼴鼠獨(dú)特的早期接觸抑制機(jī)制，其成纖維細(xì)胞分泌高分子質(zhì)量的透明質(zhì)酸（HMM-HA)等[4，5］。Beclin 1是調(diào)控自噬的重要基因，研究顯示乳腺癌、腦腫瘤、宮頸癌、卵巢癌中出現(xiàn)Beclin 1蛋白表達(dá)的下降[6，7］。多種腫瘤已經(jīng)證實(shí)存在Beclin 1等自噬基因的缺陷，能夠逃避自噬性死亡。因此，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Beclin 1是一種抑癌基因。同時(shí)Beclin 1作為參與自噬發(fā)生的特異性基因，是自噬發(fā)生的重要調(diào)控分子，在自噬形成過(guò)程中起重要作用。自噬的發(fā)生過(guò)程需要多種分子的參與，其調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜。前期我們發(fā)現(xiàn)，新生裸鼴鼠肝臟、肺臟等組織中自噬水平顯著高于C57BL/6小鼠[8，9］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了自噬相關(guān)基因Beclin1表達(dá)下調(diào)之后對(duì)裸鼴鼠細(xì)胞增殖與凋亡的影響，為深入探討B(tài)eclin 1在裸鼴鼠自噬、凋亡中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

裸鼴鼠原代皮膚成纖維細(xì)胞按照本實(shí)驗(yàn)室前期方法分離培養(yǎng)[10］；主要試劑有細(xì)胞裂解液 RIPA、PMSF、預(yù)染蛋白marker均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；AKT（Phospho-Ser473)抗體、mTOR抗體、BAX抗體購(gòu)自美國(guó)Signalway Antibody公司；βactin、p53抗體、Bcl2抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；Beclin 1抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；LC3 B抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；Annexin V-PI雙染色法試劑購(gòu)自美國(guó)BD公司；gene expresso轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自南京邁極生物公司；CCK8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Signalway Antibody公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞準(zhǔn)備

細(xì)胞接種于直徑60 mm的培養(yǎng)皿中，接種密度1×106/皿，在37℃三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)采用三氣培養(yǎng)箱控制條件為3%O2、5%CO2及 92%N2。隔天換液一次，3 d傳代。裸鼴鼠成纖維細(xì)胞的刺激分為3組:饑餓處理組、H2O2處理組、正常組。饑餓處理是指用無(wú)血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。H2O2處理采用900μmol/L H2O2進(jìn)行共孵育。正常組為3%O2、5%CO2。用于Beclin 1 siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前一天進(jìn)行鋪板，細(xì)胞用不含抗生素的正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。用于細(xì)胞RNA、蛋白提取及凋亡率檢測(cè)的細(xì)胞置于6孔板中培養(yǎng)，用于CCK8檢測(cè)的細(xì)胞置于96孔板中培養(yǎng)。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染

當(dāng)6孔板中的細(xì)胞達(dá)到90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染按照Gene Expresso轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體為，取240μL Opti-MEM培養(yǎng)液于EP管中，加入10μL siRNA，另取240μL Opti-MEM培養(yǎng)液加入10μL gene expresso，放置5 min后輕輕混勻，再室溫放置20 min，然后向其中加入1.5 mL培養(yǎng)液混勻后置換培養(yǎng)細(xì)胞中的培養(yǎng)液，同時(shí)轉(zhuǎn)染Cy3標(biāo)記的siRNA，觀察轉(zhuǎn)染效率。培養(yǎng)48 h后，用熒光顯微鏡觀察并拍照。Beclin 1 siRNA序列為:5’-CUCAAGUUCAUGCUGACCAdTdT-3’和 5’-UGGUCAGCAUGAACUUGAGdTdT-3’[11］，引物序列由百奧生物技術(shù)（南通)有限公司合成。

1.2.3 RNA的提取

Beclin 1 siRNA轉(zhuǎn)染24 h后，采用TRIzol試劑盒抽取裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞總RNA，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)260/280比值，初步確定總RNA的濃度及純度。然后用DNase I去除總RNA中的基因組DNA。將RNA按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.4 Real-time PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)

對(duì)各組織總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將cDNA進(jìn)行2倍稀釋作為檢測(cè)模板，按照設(shè)定的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，檢測(cè)各組織中Becin 1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司)設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)，應(yīng)用比較Ct法進(jìn)行相對(duì)定量。Real-time PCR反應(yīng)體系為:cDNA模板 1μL，2× SYBR Premix Ex Taq 5μL，上、下游引物（10μmol/ L)0.2μL，ROX Reference Dye（50×)0.2μL，ddH2O 3.4μL，同時(shí)設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。參考Genbank上發(fā)表的裸鼴鼠Beclin1、GAPDH基因序列設(shè)計(jì)引物為:Beclin 1:5’-GTTCAAAGAGGAGGTGGAGAAG-3’和5’-GAGGAA ACCCAGGCAAG AC-3’；GAPDH:5’-CGCCTGCTTCACCACCTT-3’and 5’-CCTGCCGCCTGGAGAAA-3’，引物序列由上海生工合成。

1.2.5 細(xì)胞蛋白的提取

Beclin 1 siRNA轉(zhuǎn)染24 h后，取6孔板細(xì)胞加0.1 mL預(yù)冷的 RIPA裂解液（含有 100 mmol/L FPSM進(jìn)行勻漿)，冰浴30 min后4℃、12 000 r/min離心30 min，吸取上清蛋白，采用Micro BCA Protein Kit測(cè)定細(xì)胞蛋白總濃度。

1.2.6 Western Blot檢測(cè)

取適量總蛋白加2×SDS上樣緩沖液，100℃變性5 min。SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，用1×封閉液室溫封閉1 h，一抗用Beclin 1、LC3B、p53、BAX、BCL2、p-AKT、mTOR抗體（1∶2000稀釋)，4℃過(guò)夜；TBST洗3次，每次5 min，二抗（1∶2000稀釋)室溫孵育1 h；TBST洗3次，每次5 min，用化學(xué)發(fā)光（ECL，普利萊公司)顯色。以β-actin為內(nèi)參照，凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。

1.2.7 流式檢測(cè)基因沉默后細(xì)胞凋亡率

Beclin 1 siRNA轉(zhuǎn)染24 h后，取6孔板細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化收集，用PBS洗滌2次（1000 r/min離心5 min)，收集細(xì)胞，加入500μL的binding buffer懸浮細(xì)胞，加入10μL annexin V-FITC和10μL PI，混勻后室溫避光防止5～15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.8 CCK8檢測(cè)基因沉默后細(xì)胞增殖率

Beclin 1 siRNA轉(zhuǎn)染 6、12、24、48 h后進(jìn)行CCK8計(jì)數(shù)，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（A)值，以間接反映各組活細(xì)胞數(shù)量。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

檢測(cè)數(shù)據(jù)用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析不同處理組凋亡率的不同，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并作t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不利刺激對(duì)裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞Beclin1表達(dá)的影響

饑餓、H2O2刺激均能導(dǎo)致Beclin 1表達(dá)水平的改變。如圖1所示，裸鼴鼠成纖維細(xì)胞饑餓或者H2O2刺激24 h后，Western blot檢測(cè)結(jié)果均顯示Beclin 1表達(dá)水平顯著下降（圖1A和1B)。

圖1 不同刺激下裸鼴鼠成纖維細(xì)胞Beclin1的表達(dá)水平Fig.1 Expression of Beclin1 in different stimulated fibroblasts from the naked mole rat

2.2 Beclin1基因沉默效果的檢測(cè)

采用Gene Expresso轉(zhuǎn)染試劑對(duì)裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到90%以上（如圖2A和2B)。同時(shí)real-time PCR及Western blot結(jié)果顯示，采用Beclin 1 siRNA可有效降低Beclin 1的表達(dá)（如圖2C和2D)。

2.3 Beclin1基因沉默對(duì)裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的影響

在轉(zhuǎn)染后的各時(shí)間點(diǎn)，裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于對(duì)照組。同時(shí)，Beclin 1基因沉默24 h后，細(xì)胞早期凋亡與晚期凋亡率均顯著升高（見(jiàn)圖3、4，P值均＜0.01)。

2.4 Beclin1基因沉默對(duì)凋亡相關(guān)基因的影響

如圖5所示，Beclin 1基因沉默24 h后，LC3B I與II總量及比值發(fā)生了變化，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中p-AKT（Ser473)與mTOR表達(dá)量下調(diào)，同時(shí)與凋亡密切相關(guān)的p53、Bcl2、BAX表達(dá)量亦下調(diào)。

3 討論

Beclin 1基因與酵母自噬基因Atg6同源，是介導(dǎo)其他自噬蛋白定位于前自噬小體的關(guān)鍵因子，也是參與哺乳動(dòng)物自噬體形成調(diào)控的特異性基因[12］。目前在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了Beclin 1單等位基因的缺失或者Beclin 1蛋白表達(dá)下調(diào)，提示其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和疾病的發(fā)生密切相關(guān)。但Beclin 1相關(guān)抑癌機(jī)制目前仍不很清楚，現(xiàn)有研究主要集中在Beclin 1作為一種自噬基因具有誘導(dǎo)自噬、凋亡及抗基因組突變的作用上。前期我們研究發(fā)現(xiàn)饑餓、H2O2刺激均能誘導(dǎo)裸鼴鼠成纖維細(xì)胞及肝星形細(xì)胞自噬水平的升高[11］，本研究結(jié)果顯示裸鼴鼠細(xì)胞饑餓條件下，Beclin 1蛋白表達(dá)量顯著降低，H2O2刺激亦可導(dǎo)致Beclin 1表達(dá)水平的下調(diào)，這提示Beclin 1在裸鼴鼠細(xì)胞抵抗饑餓及H2O2刺激時(shí)起作用。Beclin 1基因沉默可顯著抑制裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡產(chǎn)生，與凋亡密切相關(guān)的Bcl2、BAX表達(dá)量亦下調(diào)，并且LC3B總量發(fā)生了變化，說(shuō)明Beclin 1在裸鼴鼠自噬、增殖及凋亡中均發(fā)揮作用。McKnight等證實(shí)對(duì)于人類(lèi)骨肉瘤HOS細(xì)胞，下調(diào)Beclin 1基因能夠增強(qiáng)順鉑等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[13-15］。這也提示Beclin 1基因下調(diào)可以增強(qiáng)化療藥物對(duì)凋亡信號(hào)通路的激活，有助于控制腫瘤的增殖。因此，對(duì)Beclin 1基因進(jìn)行更加深入的研究將有助于腫瘤的控制。

圖2 Beclin1基因沉默效果Fig.2 The effect of Beclin 1 gene silencing

圖3 轉(zhuǎn)染24 h后裸鼴鼠成纖維細(xì)胞凋亡率Fig.3 Apoptosis of naked mole rat fibroblasts transfected for 24 h

圖4 轉(zhuǎn)染6、12、24、48 h后裸鼴鼠成纖維細(xì)胞增殖率（n=5)Fig.4 Proliferation rate of fibroblasts of the naked mole rat at 6，12，24 and 48 h after transfection（n=5)

圖5 Beclin1沉默后蛋白表達(dá)水平Fig.5 Protein expression of naked mole rat fibroblasts after siRNA inhiibtion of Beclin 1

研究顯示p53是平衡腫瘤及衰老的一個(gè)重要分界點(diǎn)，保持p53基因的穩(wěn)態(tài)表達(dá)是預(yù)防腫瘤和早衰的策略之一[16-18］。同時(shí)p53作為腫瘤抑制因子，在DNA損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮極其重要的作用。Jiang等[19］對(duì)頭頸部的腺樣囊性癌組織分析發(fā)現(xiàn)p53與Beclin 1表達(dá)量正相關(guān)。Liu等[13］研究發(fā)現(xiàn)Beclin 1可影響USP10和USP13的去泛素化活性，從而對(duì)p53蛋白水平進(jìn)行調(diào)控。因此，裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞Beclin 1基因下調(diào)之后，p53基因表達(dá)量的下調(diào)，提示Beclin 1可能調(diào)控p53的表達(dá)。同時(shí)Beclin 1基因沉默后細(xì)胞凋亡率升高，這表明下調(diào)裸鼴鼠細(xì)胞Beclin 1基因可以通過(guò)p53非依賴(lài)信號(hào)通路介導(dǎo)凋亡發(fā)生。此外，我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)Beclin 1基因后，p-AKT（Ser473)、mTOR表達(dá)量降低，提示PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路受到抑制。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)Beclin 1的缺失能夠干擾PI3K-VPS34復(fù)合物的形成[20］。Beclin 1基因下調(diào)伴隨PI3Kp85α與p-AKT的表達(dá)下調(diào)，同時(shí)細(xì)胞增殖率下降，凋亡率升高[21］。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明Beclin 1基因下調(diào)可以通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

[1］ 袁子彥，趙懿寧，張璐，等.裸鼴鼠肝臟顯微結(jié)構(gòu)與超微結(jié)構(gòu)觀察[J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，2013，33（5):373-377.

[2］ 趙善民，崔淑芳.裸鼴鼠生物學(xué)特性的研究進(jìn)展[J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，2013，33（5):400-405.

[3］ 趙善民，趙懿寧，湯球，等.裸鼴鼠胸腺、脾臟及淋巴結(jié)解剖學(xué)、組織學(xué)與超微結(jié)構(gòu)研究[J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，2013，33（5):395-399.

[4］ Seluanov A，Hine C，Azpurua J，et al.Hypersensitivity to contact inhibition provides a clue to cancer resistance of naked mole-rat [J］.Proc Natl Acad Sci U SA，2009，106（46):19352-19357.

[5］ Tian X，Azpurua J，Hine C，et al.High-molecular-mass hyaluronan mediates the cancer resistance of the naked mole rat[J］. Nature，2013，499（7458):346-349.

[6］ Cheng HY，Zhang YN，Wu QL，et al.Expression of beclin 1，an autophagy-related protein，in human cervical carcinoma and its clinical significance[J］.Eur J Gynaecol Oncol，2012，33（1):15-20.

[7］ Li Z，Chen B，Wu Y，et al.Genetic and epigenetic silencing of the beclin 1 gene in sporadic breast tumors[J］.BMC Cancer，2010，10:98.

[8］ Zhao S，Lin L，Kan G，et al.High autophagy in the nakedmole ratmay play a significant role in maintaining good health[J］. Cell Physiol Biochem，2014，33（2):321-332.

[9］ 林麗芳，趙懿寧，趙善民，等.裸鼴鼠與C57BL/6小鼠自噬調(diào)節(jié)的比較研究[J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，2013，33（4): 301-305.

[10］ 林麗芳，趙善民，肖邦，等.裸鼴鼠成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的建立[J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，2013，33（6):481-486.

[11］ Zhao S，Luo H，Kan G，et al.The protective role of autophagy in Heterocephalus glaber hepatic stellate cells exposed to H2O2or nutritional stress[J］.Cell Physiol Biochem，2014，34（2): 463-473.

[12］ Luo Sand Rubinsztein DC.Apoptosis blocks Beclin 1-dependent autophagosome synthesis:an effect rescued by Bcl-xL[J］.Cell Death Differ，2010，17（2):268-277.

[13］ Liu J，Xia H，Kim M，etal.Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13 [J］.Cell，2011，147（1):223-234.

[14］ Hou YJ，Dong LW，Tan YX，et al.Inhibition of active autophagy induces apoptosis and increases chemosensitivity in cholangiocarcinoma[J］.Lab Invest，2011，91（8):1146-1157.

[15］ Ren Y，Huang F，Liu Y，et al.Autophagy inhibition through PI3K/Akt increases apoptosis by sodium selenite in NB4 cells [J］.Bmb Reports，2009，42（9):599-604.

[16］ 邵月，胡玉璽，杜紀(jì)鋒，等.p53信號(hào)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)線粒體能量代謝延緩衰老的運(yùn)動(dòng)適應(yīng) [J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2009，29（22):2966-2968.

[17］ Hasty P and Vijg J.Accelerating aging by mouse reverse genetics:a rational approach to understanding longevity[J］.Aging Cell，2004，3（2):55-65.

[18］ Rodier F，Campisi J，and Bhaumik D.Two faces of p53:aging and tumor suppression[J］.Nucleic Acids Res，2007，35（22):7475-7484.

[19］ Jiang LC，Huang SY，Zhang DS，etal.Expression of Beclin 1 in primary salivary adenoid cystic carcinoma and its relation to Bcl-2 and p53 and prognosis[J］.Braz JMed Biol Res，2014，47（3):252-258.

[20］ Furuya N，Yu J，Byfield M，et al.The evolutionarily conserved domain of Beclin 1 is required for Vps34 binding，autophagy and tumor suppressor function[J］.Autophagy，2005，1（1):46-52.

[21］ ZhangW，LiQ，Song C，etal.Knockdown of autophagy-related protein 6，Beclin-1，decreases cell growth，invasion，andmetastasis and hasa positive effecton chemotherapy-induced cytotoxicity in osteosarcoma cells[J］.Tumour Biol，2015，36（4): 2531-2539.

Inhibitorj effects of Beclin 1 gene expression bj RNA interference on the proliferation and apoptosis in fibroblasts of naked mole rat

ZHAO Shan-min，XIAO Bang，LIN Li-fang，GONG Chen，WANG Yun-hui，CHENG Ji-shuai，YU Chen-lin，CONGWei，TANG Qiu，SUNWei，CUIShu-fang
（Laboratory Animal Center of the Second Military Medical University，Shanghai200433，China)

ObjectiveTo investigate the effects of down-regulation of Beclin 1，which is an autophagy regulatory molecule，expression induced by RNA interference on the proliferation and apoptosis in skin fibroblasts of naked mole rat.M ethodsThe expression levels of Beclin 1 were detected after starvation or H2O2treatment.The fibroblasts were transiently transfected with specific siRNA targeting Beclin 1 and then screened by real-time PCR and Western blot.Cell proliferation and apoptosis were determined using CCK-8 detection kit and flow cytometry（FCM).The expressions of related geneswere detected by Western blot.ResultsThe expression of Beclin 1 gene atmRNA and protein levels was significantly lower in fibroblasts of the nakedmole rat.Starvation and H2O2treatment induced changes of the Beclin 1 expression. Inhibition of Beclin 1 gene expression can inhibit cell proliferation and induce early and late apoptosis.The protein levels of p53，BAX，Bcl2，LC3B，p-AKT and mTOR were reduced after transient transfection with Beclin 1-siRNA.ConclusionsThe expression of Beclin 1 in fibroblasts of nakedmole ratare changed in response to starvation or H2O2stimulation.Inhi-bition of Beclin 1 gene expression can inhibit cell proliferation and induce apoptosis.Therefore，Beclin1 gene may play a regulatory role in autophagy，proliferation and apoptosis in the skin fibroblasts of naked mole rat.

Naked mole rat；Fibroblasts；Beclin 1；siRNA；Proliferation；Apoptosis

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0557-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.002

2015-11-15

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（No.2015BAI09B02)；國(guó)家自然科學(xué)基金（No.31402028)與上海市衛(wèi)計(jì)委課題（No.20144Y0205)聯(lián)合資助。

趙善民（1986-)，男，碩士，講師，研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化及人類(lèi)疾病動(dòng)物模型研究。

崔淑芳，教授，研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化及人類(lèi)疾病動(dòng)物模型研究。Email:youngstar_sf@163.com，