高艷新，朱玉潔，劉瑩，符健，楊照新*

（1.承德市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北承德 067000；2.海南醫(yī)學(xué)院海南省藥物安評(píng)中心，海口 571199)

研究報(bào)告

血藍(lán)蛋白不同免疫途徑對(duì)小鼠T細(xì)胞依賴性抗體反應(yīng)的影響

高艷新1，朱玉潔2，劉瑩2，符健2，楊照新2*

（1.承德市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北承德 067000；2.海南醫(yī)學(xué)院海南省藥物安評(píng)中心，海口 571199)

目的探討以血藍(lán)蛋白（KLH)為特異性T細(xì)胞依賴性抗原，不同免疫途徑下對(duì)小鼠T細(xì)胞依賴性抗體反應(yīng)（TDAR)的影響。方法選用SPF級(jí) KM小鼠，分為靜脈注射組、皮下注射組、腹腔注射組及空白對(duì)照組。通過上述三種途徑免疫小鼠，免疫劑量為每只200μg，第10天等劑量加強(qiáng)免疫一次，空白對(duì)照組不給予任何藥物。于末次免疫后第7天，采血檢測(cè)血清KLH抗體IgG含量，計(jì)算脾臟器系數(shù)，HE染色觀察脾組織學(xué)變化。結(jié)果KLH三種不同免疫途徑均可引起脾出現(xiàn)不同程度次級(jí)淋巴濾泡及生發(fā)中心的形成，B淋巴細(xì)胞凋亡，邊緣區(qū)細(xì)胞增多等病理改變，以腹腔和靜脈免疫途徑脾形態(tài)變化更為明顯；三種不同免疫途徑均可引起機(jī)體產(chǎn)生抗體，與正常對(duì)照組相比差異具有顯著性（P＜0.05)，其中靜脈途徑引起抗體產(chǎn)生濃度最高，明顯高于其他兩種免疫途徑（P＜0.05)；各組脾臟器系數(shù)存在部分差異，其中靜脈注射組和腹腔注射組脾臟器系數(shù)顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05)，靜脈注射組脾臟器系數(shù)顯著高于皮下注射組和腹腔注射組（P＜0.05)。結(jié)論KLH三種不同免疫途徑引起機(jī)體產(chǎn)生抗體濃度、脾臟器系數(shù)及形態(tài)改變是不完全相同的，可通過這些差異多方面分析TDAR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

血藍(lán)蛋白；T細(xì)胞依賴性抗體反應(yīng)；脾臟系數(shù)；抗體；免疫；IgG；小鼠

T細(xì)胞依賴性抗體反應(yīng)（T-cell dependent antibody response，TDAR)是B細(xì)胞針對(duì)T細(xì)胞依賴性抗原產(chǎn)生特異性抗體的一種綜合免疫功能反應(yīng)，是檢測(cè)藥物免疫毒性首選的一線試驗(yàn)[1］。近年以血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH)做為特異性T細(xì)胞依賴性抗原的TDAR，已廣泛用于藥物臨床前免疫毒性研究[2，3］。但有關(guān)KLH不同免疫途徑對(duì)TDAR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，目前報(bào)道不多。本文以KLH為特異性T細(xì)胞依賴性抗原，探討不同免疫途徑對(duì)小鼠TDAR實(shí)驗(yàn)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠48只購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK（湘)2011-0003］，雌雄各半，3～4周齡，體重18～22 g左右；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及操作均在海南省藥物安全性評(píng)價(jià)研究中心[SYXK（瓊)2012-0013］進(jìn)行。

1.2 主要試劑來源

小鼠KLH單克隆抗體（12B4.G3.A8)購自Abcam公司（貨號(hào)ab34607)；辣根過氧化物酶（HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；KLH購自Sigma公司（貨號(hào)H7017)。

1.3 研究方法

48只KM小鼠隨機(jī)分為四組，分為靜脈注射組、皮下注射組、腹腔注射組及空白對(duì)照組，每組12只，雌雄各半。通過上述三種途徑免疫小鼠，參考文獻(xiàn)[4］起始免疫劑量為每只200μg，第10天等劑量加強(qiáng)免疫一次，空白對(duì)照組不給予任何藥物。于末次免疫后第7天，經(jīng)眼球采血，參考文獻(xiàn)方法[5］檢測(cè)血清KLH抗體IgG含量，分離脾并稱重，計(jì)算脾臟器系數(shù)，4%中性甲醛溶液固定脾，HE染色觀察組織形態(tài)變化。

1.4 血清KLH抗體IgG含量檢測(cè)方法

將抗原KLH以濃度為5μg/mL包被酶標(biāo)板，待檢血清以1∶20濃度稀釋，酶標(biāo)二抗以1∶20 000濃度稀釋，將樣品中待測(cè)抗體與KLH結(jié)合成固相抗原-受檢抗體復(fù)合物，再用酶標(biāo)二抗與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成固相抗原-受檢抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，加底物顯色，確定待測(cè)抗體含量。標(biāo)準(zhǔn)品為小鼠KLH單克隆抗體，最高濃度為200 ng/L，倍比稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 脾病理組織學(xué)檢查結(jié)果

KLH不同免疫途徑均可引起脾形態(tài)發(fā)生變化，以腹腔注射組和靜脈注射組形態(tài)變化更為明顯，皮下注射組次之?？沙霈F(xiàn)次級(jí)淋巴濾泡及生發(fā)中心的形成，B淋巴細(xì)胞凋亡，邊緣區(qū)細(xì)胞增多等病理改變（見圖1)。

2.2 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清KLH抗體IgG和脾臟器系檢測(cè)結(jié)果

表1結(jié)果顯示:三種不同KLH免疫途徑均可引起機(jī)體產(chǎn)生抗體，與正常對(duì)照組相比差異有顯著性（P＜0.05)，其中靜脈途徑引起抗體產(chǎn)生濃度最高，明顯高于其他兩種免疫途徑（P＜0.05)。各組脾臟臟器系數(shù)存在部分差異，其中靜脈注射組和腹腔注射組脾臟器系數(shù)顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05)；靜脈注射組脾臟器系數(shù)顯著高于皮下注射組和腹腔注射組（P＜0.05)。

圖1 各組脾病理組織學(xué)檢查結(jié)果（×400)Fig.1 Histological changes of the spleen in various groups.×400

表1 各組血清KLH抗體IgG含量和脾臟器系數(shù)檢測(cè)結(jié)果（±s，n=12)Tab.1 The spleen coefficient and serum KLH IgG in various groups

表1 各組血清KLH抗體IgG含量和脾臟器系數(shù)檢測(cè)結(jié)果（±s，n=12)Tab.1 The spleen coefficient and serum KLH IgG in various groups

注:與空白對(duì)照組相比aP＜0.05；與皮下注射組和腹腔注射組相比bP＜0.05.Note.Compared with the control group，aP＜0.05；Compared with the subcutaneous injection and intraperitoneal injection groups，bP＜0.05.

組別Groups臟器系數(shù)/mg/g Organ coefficient空白對(duì)照組Control 89.58±7.56 3.86±0.94靜脈注射組Intravenous injection 379.16±38.81ab4.90±0.89ab皮下注射組Subcutaneous injection 281.23±55.78a3.98±1.03腹腔注射組Intraperitoneal injection 291.45±68.67a4.23±0.91aKLH IgG/ng/L

3 討論

以KLH為特異性T細(xì)胞依賴性抗原的TDAR實(shí)驗(yàn)是免疫毒理學(xué)研究中考察藥物免疫毒性較好的功能性實(shí)驗(yàn)，它可以反映藥物對(duì)免疫系統(tǒng)整體的影響，并且比傳統(tǒng)的TDAR實(shí)驗(yàn)（綿羊紅細(xì)胞)在抗原特異性、操作性及標(biāo)準(zhǔn)化等問題上，具有明顯的優(yōu)勢(shì)[1］。KLH是一種可溶性的、具有高度免疫原性的蛋白[6］，是從海洋軟體動(dòng)物中提取出來的一種多聚體蛋白，具有可溶性和高度免疫原性，分子量在（350～400)×103，比SRBC具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、易標(biāo)準(zhǔn)化、保質(zhì)期長和不易變質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，更適合作為T細(xì)胞依賴性抗原。TDAR實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)決定了它可以很好地反應(yīng)免疫抑制或刺激類藥物對(duì)免疫系統(tǒng)的整體影響，尤其是一些化療藥物或抗癌藥物，但是固定的免疫途徑對(duì)于不同的免疫抑制或刺激藥物未必都能體現(xiàn)免疫毒性。此外一些已知免疫抑制劑如抗癌藥物，本身就存在免疫抑制，需要考察的是其免疫抑制程度，可能需要與之相適應(yīng)的免疫方法，特別是在評(píng)價(jià)一些腫瘤化療藥的免疫抑制程度顯得尤為重要[7］。

本文通過研究以KLH為免疫原，KM種小鼠在不同的免疫途徑的不同免疫效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，腹腔、靜脈及皮下等三種不同免疫途徑均可引起脾出現(xiàn)不同程度次級(jí)淋巴濾泡及生發(fā)中心的形成，B淋巴細(xì)胞凋亡，邊緣區(qū)細(xì)胞增多等病理改變，以腹腔和靜脈免疫途徑脾形態(tài)變化更為明顯；同時(shí)三種不同免疫途徑均可引起機(jī)體產(chǎn)生抗體，與正常對(duì)照組相比具有顯著差異（P＜0.05)，其中靜脈途徑引起抗體產(chǎn)生濃度最高，明顯高于其他兩種免疫途徑（P＜0.05)；各組脾臟器系數(shù)存在部分差異，其中靜脈注射組和腹腔注射組脾臟器系數(shù)顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05)，靜脈注射組脾臟器系數(shù)顯著高于皮下注射組和腹腔注射組（P＜0.05)。這些結(jié)果表明KLH的三種不同免疫途徑均可引起機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，脾臟器系數(shù)及形態(tài)也發(fā)生不同程度的改變。但不同的免疫途徑免疫效果又不完全相同，我們完全可通過這些差異多方面分析TDAR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。并且如能根據(jù)這些差異，包括不同的免疫濃度、免疫途徑、免疫劑量、免疫器官的形態(tài)變化以及免疫后一些細(xì)胞因子的改變等等，建立以KLH為特異性抗原的TDAR實(shí)驗(yàn)等級(jí)分析方法，定能有效地推動(dòng)TDAR檢測(cè)方法的發(fā)展和標(biāo)準(zhǔn)化。

[1］ 霍艷，艾文超，苗玉發(fā)，等.T細(xì)胞依賴性抗體反應(yīng)檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J］.中國新藥雜志，2011，20（17):1620-1623.

[2］ Peachee VL，Smith MJ，Beck MJ，et al.Characterization of the T-dependentantibody response（TDAR)to keyhole limpethemocyanin（KLH)in the Gottingen minipig[J］.J Immunotoxicol，2014，（11)4:376-382.

[3］ Vandebriel RJ，Tonk ECM，De La Fonteyne-Blankestijn LJ，et al. Immunotoxicity of silver nanoparticles in an intravenous 28-day repeated-dose toxicity study in rats[J］.Particle Fibre Toxicol，2014，11（1):21.

[4］ Aulim，Domenech A，Andres A，etal.Multiparametric immunotoxicity screening inmice during early drug development[J］.Toxicol Lett，2012，214（2):200-208.

[5］ 侯俊，劉澤，謝國明，等.新型呼腸病毒S基因DNA疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫原性[J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2014，22（4):24 -27.

[6］ Lebrec H，Hock MB，Sundsmo JS，et al.T-cell-dependent antibody responses in the rat:forms and sources of keyhole limpet hemocyanin matter[J］.J Immunotoxicol，2014，11（3):213-221.

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Effect of different routes of kejhole lim pet hemocjanin immunization on the T cell dependent antibodj response in m ice

GAO Yan-xin1，ZHU Yu-jie2，LIU Ying2，F(xiàn)U Jian2，YANG Zhao-xin2*
（1.Clinical Laboratory，Chengde City Hospital of Traditional Chinese Medicine，Chengde 067000，China. 2.Research Center for Drug Safety Evaluation，Hainan Medical College，Haikou 571199)

ObjectiveTo study the influence of different routes of keyhole limpet hemocyanin（KLH)immunization on the T-cell-dependent antibody response in mice.MethodsSPF Kunmingmice were divided into four groups:the intravenous injection group，subcutaneous injection group，intraperitoneal injection group and control group.Each mouse was injected 200μg KLH intravenously，subcutaneously or intraperitoneally daily for consecutive 10 days，respectively. Mice in the control group were given solvent injection only.Serum concentration of IgG stimulated by KLH antigen was measured 7 days after the last dosing.Spleen was isolated to calculate the organ coefficient and examined by pathology using hematoxylin and eosin staining.ResultsIntravenously，subcutaneously and intraperitoneally administered KLH stimulated the generation of secondary lymphoid follicles and germinal center to varying degrees，B cell apoptosis，increased amount of cells in themarginal zone and other pathological changeswere observed in the spleen.Intravenous and intraperito-neal administration of KLH led tomore pronounced pathological changes compared with that in the subcutaneous injection group.All of the three administration routes of KLH induced generation of IgG antibody，significantly higher than that in the control group（P＜0.05).Intravenous injection of KLH generated the highest concentration of IgG and organ coefficient among the three administration routes（P＜0.05).ConclusionsDifferent immunization routes do affect the production of IgG antibody，organ coefficientand pathological changes in the spleen，and these differences should be taken into consideration when analyzing the T cell dependent antibody response in mice.

Keyhole limpet hemocyanin，KLH；Immunization；T-cell-dependent antibody response，TDAR；Spleen index；Antibody；Mouse

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0639-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.018

2015-07-07

海南省重大科技專項(xiàng)項(xiàng)目（ZDZX2013003)。

高艷新，女，主管檢驗(yàn)師，主要從事臨床檢驗(yàn)數(shù)據(jù)分析與動(dòng)物建模。E-mail:568659214@qq.com。

楊照新，男，副研究員，從事藥物安全性評(píng)價(jià)研究工作。Email:168494512@qq.com.