王運林，匡德宣，馬朝霞，王婭娟，張利東，高斌，徐顯鑫，胡敏*，段宜強*

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽 550025；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心，昆明 650118；3.昆明學(xué)院，昆明 650214；4.昆明醫(yī)科大學(xué)，昆明 650500)

研究報告

去卵巢法骨質(zhì)疏松樹鼩模型的建立

王運林1，匡德宣2，馬朝霞3，王婭娟3，張利東3，高斌3，徐顯鑫4，胡敏3*，段宜強1*

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽 550025；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心，昆明 650118；3.昆明學(xué)院，昆明 650214；4.昆明醫(yī)科大學(xué)，昆明 650500)

目的采用手術(shù)雙側(cè)卵巢去勢法復(fù)制人絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松樹鼩模型。方法100只雌性樹鼩納入實驗，參照中華醫(yī)學(xué)會骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病分會2011年發(fā)布的《原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥臨床診療指南》（以下簡稱《指南》)診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行模型評價:①根據(jù)人自然壽命、性成熟時間、骨密度（BMD)峰值年齡及樹鼩自然壽命、性成熟時間，推測樹鼩BMD峰值月齡。隨機抽取6、12、18、24月齡樹鼩各6只行全身BMD檢測，比較各月齡段BMD差異，驗證樹鼩BMD峰值月齡；②從余下的樹鼩中隨機抽取BMD峰值月齡段樹鼩62只行BMD檢測，確定樹鼩BMD峰值均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差。然后將其隨機分為模型組（n=32)與空白組（n=30)，模型組手術(shù)切除雙側(cè)卵巢，空白組切除與卵巢等體積的大網(wǎng)膜，各組分別于術(shù)后3、6、9、12月時隨機抽取6只行BMD檢測，對BMD值符合《指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)者取材行病理檢測驗證。結(jié)果①6、12、18、24月齡段受測樹鼩BMD峰值分別為（0.138±0.012)、（0.143 ±0.010)、（0.141±0.009)、（0.139±0.009)g/cm2，各月齡樹鼩BMD峰值差異無顯著性（P＞0.05)；②樹鼩BMD峰值均數(shù)為（0.143±0.016)g/cm2；③模型組各時相點BMD值符合《指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)的樹鼩的數(shù)量分別為0、5、4、5只，其脛骨近端病理切片與6月齡樹鼩比較:骨小梁稀疏、斷裂，小梁間距增寬；空白組各時相點BMD值符合《指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)的樹鼩數(shù)量均為0，其脛骨近端病理切片與6月齡樹鼩比較無異常。結(jié)論按《指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)判斷，6月齡雌性樹鼩行雙側(cè)卵巢去勢術(shù)后6月可復(fù)制出人絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型，造模成功率較高，模型穩(wěn)定。

樹鼩；卵巢切除術(shù)；骨質(zhì)疏松；骨密度；石蠟病理檢查

目前，用于骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP)造模的動物有:大鼠、兔、犬、羊和非人靈長類動物等[1-3］，OP模型中廣泛使用的動物是大鼠，但大鼠缺乏哈弗氏系統(tǒng)[4］；兔具有哈弗氏系統(tǒng)，但松質(zhì)骨含量少，對檢測帶來一定困難[5］；犬的雌激素分泌水平明顯低于人類，卵巢和子宮切除不會誘發(fā)明顯的骨丟失[6］。非人靈長類動物可較好地復(fù)制人類OP模型，但飼養(yǎng)困難、體型大、成本高、實驗周期長，因而使用受到限制[7］。故采用上述動物復(fù)制的人類OP模型均存在一定不足。云南省重點開發(fā)的實驗動物樹鼩是攀鼩目樹鼩科動物，其大拇指（趾)與其他指（趾)分開、脛骨與腓骨獨立、牙齒具有前臼齒等特征；月經(jīng)周期為（26.5±8.3)d[8］，與人相似；全基因組測序發(fā)現(xiàn)其比小鼠、大鼠、犬等與人有更高的同源性[9］，與目前常用的非人靈長類動物相比，具有體型小，易于飼養(yǎng)，繁殖率高，成本低等優(yōu)點，適合于人絕經(jīng)后OP模型的研究。本研究采用手術(shù)雙側(cè)卵巢去勢法復(fù)制絕經(jīng)后OP樹鼩模型，擬為OP的研究提供新型動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器

鹽酸塞拉嗪注射液（1.5×10-3L:0.03 g，聖鑫)；鹽酸苯噁唑注射液（2×10-3L:0.03 g，聖鑫)；雙能X線骨密度測量儀（Prodigy Advance型，美國GE-Lunar公司)；顯微鏡（Nikon Eclipse Ci-E，日本)；電腦超薄切片機（KD-3358，Kedee)。

1.1.2 實驗動物

100只滇西亞種雌性樹鼩，體重（128.603± 5.997)g，6～24月齡，實驗所用樹鼩均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究所提供【SCXK（滇)K2013-0001】；實驗在昆明學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究中心【編號: SYXK（滇)K2014-0002】進(jìn)行。運輸應(yīng)激反應(yīng)及麻醉意外共死亡14只。

1.2 方法

1.2.1 確定滇西亞種雌性樹鼩 BMD峰值均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差

（1)確定滇西亞種雌性樹鼩BMD峰值取樣個體月齡:根據(jù)中國女性性成熟年齡18歲[10］，女性人均期望壽命76.7歲[11］，女性 BMD峰值年齡30歲左右[12］；雌性樹鼩性成熟年齡 6月，與雌性樹鼩自然壽命8～12歲[13］；推算樹鼩BMD峰值月齡。

（2)抽樣驗證滇西亞種雌性樹鼩BMD峰值:隨機抽取6、12、18、24月齡雌性樹鼩各6只行 BMD檢測，LSD-t檢驗比較不同月齡樹鼩間的BMD峰值差異，驗證滇西亞種雌性樹鼩BMD峰值適宜的取樣月齡。

（3)確定本研究中滇西亞種雌性樹鼩 BMD峰值均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差:隨機抽取BMD峰值月齡雌性樹鼩62只行BMD檢測，計算其均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差，以此作為滇西亞種雌性樹鼩BMD峰值均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.2 造模動物與分組

隨機選取適齡BMD峰值月齡雌性樹鼩62只，隨機分為模型組（n=32)與空白組（n=30)。臀肌注射鹽酸塞拉嗪注射液（注射劑量:0.2×10-3L/ 100 g)麻醉后，無菌條件下取腹正中切口，進(jìn)入腹腔。模型組動物均切除雙側(cè)卵巢，空白組動物均切除與卵巢等體積的大網(wǎng)膜。術(shù)后立即注射鹽酸苯噁唑注射液（注射劑量:0.4×10-3L/100 g)，保溫，常規(guī)飼養(yǎng)，嚴(yán)密觀察進(jìn)食、活動、掉毛、患病以及死亡情況，并記錄。兩組動物均于術(shù)前、術(shù)后3、6、9、12個月各隨機抽取6只行BMD檢測；BMD值符合《指南》[14］診斷標(biāo)準(zhǔn)者即時取材病理檢測。

1.2.3 檢測方法

（1)骨密度（BMD)檢測:測量參數(shù):電壓76.0 kV；電流0.150 mA；時間63 s；輻射劑量0.20 mrem。

（2)骨組織形態(tài)學(xué)觀察:實驗動物臀肌注射大量鹽酸塞拉嗪注射液安樂死后，取右側(cè)脛骨近端0.2 cm置于4% 多聚甲醛溶液中固定24 h，磷酸鹽緩沖液沖洗后再置于25% 甲酸中浸泡脫鈣，3 d后取出脫水。石蠟切片、蘇木精-伊紅（HE)染色，顯微鏡下觀察骨組織形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，計算結(jié)果以（±s)形式表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩的一般狀況

造模前及空白組樹鼩毛發(fā)光潔，活動體態(tài)正常；模型組逐漸出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍，活動遲緩，毛色無光澤、稀疏、脫落。

2.2 確定本研究滇西亞種雌性樹鼩BMD峰值

推算出滇西亞種雌性樹鼩BMD峰值月齡為10.8月；6、12、18、24月齡段受測樹鼩BMD峰值分別為（0.138±0.012、0.143±0.010、0.141±0.009、0.139±0.009)g/cm2，6、12、18、24月齡段雌性樹鼩BMD峰值差異無顯著性（P＞0.05)；62只6月齡雌性樹鼩BMD值為（0.143±0.016)g/cm2，見表1；據(jù)此確定本研究中滇西亞種雌性樹鼩BMD峰值為（0.143±0.016)g/cm2。

表1 62只6月齡雌性樹鼩BMD（g/cm2)值Tab.1 The value of BMD from 62 6-month-old female tree shrews（g/cm2)

2.3 造模結(jié)果

2.3.1 造模動物的BMD檢測結(jié)果

兩組樹鼩BMD值隨時間變化情況見圖1，模型組BMD逐漸降低，6個月時最明顯，且一直持續(xù)到12月；空白組在正常范圍內(nèi)波動。按《指南》標(biāo)準(zhǔn)判斷（骨密度降低程度等于和大于同性別、同種族正常成人的骨峰值2.5個標(biāo)準(zhǔn)差為骨質(zhì)疏松)，雙側(cè)卵巢去勢術(shù)后3、6、9、12個月時成模樹鼩數(shù)量分別為0、5、4、5只，造模成功率分別為0%、83%、66%、83%；空白組各時相點BMD值符合《指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)的樹鼩數(shù)量均為0，見表3。

圖1 各時相點樹鼩全身BMD變化Fig.1 Changes of total body BMD of the tree shrews at different time points

表2 各時相點造模結(jié)果（n=6)Tab.1 The results ofmodeling at different time points

2.3.2 光鏡觀察結(jié)果

普通光鏡100倍下觀察，6月齡雌性樹鼩骨小梁排列均緊密，小梁寬厚、間距小，小梁之間連接豐富，骨髓細(xì)胞多，脂肪空泡少。造模后6個月時，空白組與造模前比較無明顯差異；模型組骨小梁數(shù)量顯著減少，排列稀疏，小梁斷裂，骨髓細(xì)胞減少，脂肪空泡多，與造模前及空白組相比較差異有顯著性，見圖2。

圖2 樹鼩脛骨近端病理切片HE染色觀察（×100)Fig.2 Histological changes of the proximal tibia of tree shrews（HE staining，×100)

3 討論

骨質(zhì)疏松患病率隨著人口老齡化而逐年增加[15］。目前我國OP患者近7000萬人，其中絕經(jīng)后OP患者約占80%，且發(fā)病機理尚不完全清楚，現(xiàn)有防治策略效果有限[16］。動物模型是進(jìn)行絕經(jīng)后OP基礎(chǔ)與臨床研究的基礎(chǔ)[17］。雙側(cè)卵巢去勢法是最常用的研究絕經(jīng)后OP的造模方法，其優(yōu)點是可較好地模擬絕經(jīng)后OP的病理生理狀態(tài)，造模成功率高、穩(wěn)定性可靠、重復(fù)性好、適用范圍廣[18］。本研究證實了采用手術(shù)雙側(cè)卵巢去勢法復(fù)制人類OP樹鼩模型，具有較高的成模率；動物成模后動態(tài)監(jiān)測BMD提示此OP模型具有較好的穩(wěn)定性。

評價OP動物模型的指標(biāo)主要有BMD、超微螺旋CT、骨組織形態(tài)學(xué)、生化指標(biāo)和生物力學(xué)等，其中雙能X線吸收法是診斷OP的“金標(biāo)準(zhǔn)”[19］，骨組織形態(tài)學(xué)檢測可直觀地觀測與評價OP的程度。故本研究采用BMD與骨組織形態(tài)學(xué)相結(jié)合的方法評價OP樹鼩模型，兩種檢測方法互為補充，結(jié)果吻合度高，方便快捷，可較好滿足本研究實驗設(shè)計需求。

目前文獻(xiàn)常以造模后相同時相點模型組與空白組BMD值的差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義為評價OP動物模型的標(biāo)準(zhǔn)，其優(yōu)點是實驗體系相對封閉，直接進(jìn)行模型組與空白組之間的比較，方便快捷；缺點是結(jié)果判斷以參照組的BMD值為標(biāo)準(zhǔn)而非以種群的BMD峰值為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)計理念與《指南》規(guī)定的人類臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)不盡相符。本研究中，組織學(xué)檢測結(jié)果證明參照《指南》標(biāo)準(zhǔn)評價樹鼩OP模型可較好地反映OP的疾病特征。

以《指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，以 BMD與組織學(xué)檢測為主要評價手段，6月齡雌性樹鼩行雙側(cè)卵巢去勢術(shù)后6個月能成功建立OP模型，且具有造模成功率高、模型穩(wěn)定的優(yōu)點。由于樹鼩是近年開始發(fā)展的實驗動物，尚缺乏必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，遺傳背景不完全清楚，尚未標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)模化飼養(yǎng)，可納入實驗的樹鼩數(shù)量過少，因而本研究結(jié)果尚缺乏廣泛的代表性。

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Establishment of an osteoporosismodel in tree shrews bj bilateral ovariectom j

WANG Yun-lin1，KUANG De-xuan2，MA Zhao-xia3，WANG Ya-juan3，ZHANG Li-dong3，GAO Bin3，XU Xian-xin4，HU Min3*，DUAN Yi-qiang1*
（1.Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China；2.Center of Tree Shrew Germplasm Resources，Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Kunming 650118；3.Kunming University，Kunming 650214；4.Kunming Medical University，Kunming 650500)

ObjectiveTo establish an osteoporosis model in tree shrews by bilateral ovariectomy.Methods One hundred healthy 6-24month old female tree shrewswere used in this study.The diagnosis and treatmentofosteoporosis in themodel tree shrewswas assessed according to the Interpretation of the Clinical Practice Guideines for Primary Osteoporosis 2011 released by the Chinese Medical Association of Osteoporosis and Bone Mineral Salt Disease Branch.① According to the human natural life span，sexualmaturation time and peak bonemineral density（PBMD)and the tree shrew natural life span and sexualmaturation time，we estimated the PBMD of tree shrew in the age ofmonths.Six 6-，12-，18-and 24-month old tree shrews in each group were randomly taken formeasurement of BMD，and compared the differences between groups to verify the PBMD age of tree shrews.②We chose 62 6-month old tree shrews from the restof tree shrews tomeasure their BMD to determine themean and standard deviation of BMD.Then we divided them into study group（n= 32)and control group（n=30).Bilateral ovariectomy was performed in the study group，while omentectomy was done in the control group.BMD wasmeasured at3，6，9，12 months after the surgery，6 animals from each group.The animals which met the criteria of guideline were taken for pathological examination.Results①The PBMD of6-，12-，18-，24-month old tree shrews was 0.138±0.012，0.143±0.010，0.141±0.009，and 0.139±0.009)g/cm2，respectively，showing no significant differences among them（P＞0.05).②Themean PBMD of the tree shrews was 0.143±0.016 g/ cm2.③In themodel groups，the number of tree shrewswhose BMDmet the criteria of guideline was0，5，4，5，respectively.The pathological examination of the proximal tibia from themodel group showed sparse and some disrupted trabeculae and enlarged inter-trabecular space.In the control group，the tibia tissues showed normal histology of bone structure and no one tree shrew showed a BMD value whichmet the criteria of diagnosis of osteoporosis.Conclusions An osteoporosismodel in tree shrews can be established at6 months after bilateral ovariectomy，showing similarmanifestation of osteoporosis in postmenopausalwomen.The success rate of thismodelingmethod is high and themodel is stable.

Tree shrew；Ovariectomy；Osteoporosis；Bonemineral density；Pathology

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0562-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.003

2015-09-24

國家科技支撐計劃項目子課題（2014BAI01B01)。

王運林（1988-)，男，碩士生，研究方向:骨關(guān)節(jié)，E-mail:185281780@qq.com。

段宜強，副主任醫(yī)師，研究方向:骨關(guān)節(jié)，手顯微，E-mail:784853938@qq.com。胡敏，教授，主要研究方向:骨科基礎(chǔ)與臨床，E-mail:576794680@qq.com。