王瑩，梁勇，張彥明，吳德沛，劉海燕

(1蘇州大學附屬第一人民醫(yī)院，江蘇蘇州215006;2蘇州大學生物醫(yī)學研究院;3連云港市第一人民醫(yī)院;4淮安市第二人民醫(yī)院)

硼替佐米是一種蛋白酶體抑制劑，經體內外實驗研究證實，其對多種腫瘤細胞系均有抑制作用。近年來，人們發(fā)現(xiàn)其對免疫細胞如T細胞、NK細胞等均具有抑制作用。2013年2月～2014年6月，我們研究了硼替佐米對小鼠骨髓來源的樹突狀細胞(DC)的免疫調節(jié)作用，并探討了其作用機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物:SPF級C57BL/6小鼠(雄性，6～8周齡)，體質量18～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，層流環(huán)境下無菌飼養(yǎng)，每天紫外線照射消毒，飼養(yǎng)籠、食物、飲水均經高壓消毒。藥物與試劑:硼替佐米(楊森公司贈送)用PBS配制成2.5 mmol/L溶液，避光，于-70℃分裝保存，使用前用無血清的PRMI1640培養(yǎng)基稀釋為所需濃度。重組小鼠?！奘杉毎浯碳ひ蜃?rmGM-CSF)購于杭州隆基生物制品公司;重組小鼠IL-4(rmIL-4)購于PeproTect公司;CCK-8試劑盒為日本同仁化學研究所產品;流式細胞術檢測所需熒光抗體均購于BD公司;ELISA試劑盒購于達科為公司;電泳遷移率分析(EMSA)試劑盒為唯奧基因公司產品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓來源DC的制備 按照Inaba等［1］的方法并加以改進。頸椎脫位法處死C57BL/6小鼠，無菌狀態(tài)下取股骨及脛骨，用1 mL注射器抽取無血清的PRMI1640培養(yǎng)基沖出骨髓細胞，用紅細胞裂解液(0.15 mol/L NH4Cl、0.01 mmol/L KHCO3、0.1 mmol/L EDTA-Na2)去除紅細胞并洗滌后，培養(yǎng)在含10%胎牛血清(GIBCO公司產品)、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺及 10 ng/mL rmGM-CSF、1 ng/mL rmIL-4 的 PRMI1640培養(yǎng)基內，于37℃、飽和濕度、5%CO2條件下培養(yǎng)。48 h后，吸去懸浮細胞，僅保留貼壁細胞，加入新鮮的完全培養(yǎng)基及相同濃度的rmGM-CSF及rmIL-4。隔日半量換液，培養(yǎng)至第6天。

1.2.2 CCK-8法檢測硼替佐米對DC的抑制率于DC培養(yǎng)的第6天，離心收集懸浮細胞，以5×105/mL接種于96孔板，分別加入2、10、50 nmol/L的硼替佐米，同時設空白對照組，置37℃、飽和濕度、5%CO2的恒溫孵箱中培養(yǎng)24、48及72 h后，加入CCK-8試劑10 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標儀在450 nm處讀取吸光度值。

1.2.3 流式細胞術檢測DC表面共刺激分子的表達 于DC培養(yǎng)的第6天，離心收集細胞，以1×106/mL接種于24孔板，分別加入LPS和(或)2、10、50 nmol/L的硼替佐米，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，離心收集細胞，PBS洗2遍后，每管分別加入FITC標記的倉鼠抗小鼠 CD11c，抗 CD40、抗 CD80、抗 CD86、抗MHCⅡ及小鼠IgG同型對照抗體各1 μL，陰性對照管不加任何抗體。4℃避光放置30 min，加入PBS至0.5 mL，以1 500 r/min離心2 min后棄上清。PBS洗2遍，加入0.5 mL PBS吹打混勻細胞，上流式細胞儀分析。

1.2.43H-胸腺嘧核苷(TdR)摻入法觀察異基因淋巴細胞增殖情況 按上述方法培養(yǎng)小鼠骨髓來源的DC至第6天，收集細胞，經過 LPS和(或)2、10、50 nmol/L硼替佐米預處理24 h后，作為刺激細胞，加入濃度為25 ng/mL的絲裂霉素C，37℃孵育30 min，PBS清洗后用RPMI1640培養(yǎng)液重懸，DC濃度調整為 5×105/mL、1×105/mL、5×104/mL。另取BALB/C小鼠脾細胞作為反應細胞，用玻片研磨，裂解紅細胞，濃度調整為1×106/mL。兩種細胞各取100 μL于U形底96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，另加rhIL-2(50 U/L)刺激培養(yǎng)。在混合淋巴反應體系(MLR)終止培養(yǎng)16 h前每孔加入培養(yǎng)基稀釋的3H-TdR(1 μCi/孔)10 μL。用細胞收集器將每孔培養(yǎng)物分別吸收在玻璃纖維濾紙上，吹風機烘干，然后將濾紙片浸入3 mL脂溶性閃爍液，置于β-液體閃爍記數(shù)儀中測定每個樣品的每分鐘脈沖數(shù)(cpm值)。

1.2.5 ELISA法檢測DC培養(yǎng)上清及MLR上清液中細胞因子表達 收集LPS和(或)2、10、50 nmol/L的硼替佐米作用24 h后的DC培養(yǎng)上清，用ELISA法檢測IL-12、TNF-α的濃度?；旌狭馨图毎囵B(yǎng)后，收集MLR培養(yǎng)上清，ELISA法檢測TNF-α、IFN-γ的濃度。具體方法按照試劑盒操作說明書進行。

1.2.6 電泳造移率分析法(EMSA法)檢測DC NF-κB入核活性 于DC培養(yǎng)的第6天，離心收集細胞，以1×106/mL接種于24孔板，分別加入LPS和(或)2、10、50 nmol/L的硼替佐米，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，離心收集細胞，提取核蛋白，測定蛋白濃度，之后按照試劑盒操作說明書進行分析。

1.2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。均數(shù)以±s表示，比較采用方差分析。P≤0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 不同濃度硼替佐米在不同時間對DC的抑制作用 見表1。隨硼替佐米劑量增加及作用時間延長，對DC的抑制率升高(P均＜0.05)。

2.2 不同濃度硼替佐米對DC表面共刺激分子表達的影響 見表2。

表1 不同濃度硼替佐米在不同時間對DC的抑制作用(%，±s)

表1 不同濃度硼替佐米在不同時間對DC的抑制作用(%，±s)

注:與0 nmol/L比較，*P＜0.05;與2 nmol/L比較，aP＜0.05;與10 nmol/L比較，bP＜0.05;與24 h比較，#P＜0.05;與48 h比較，@P＜0.05。

硼替佐米 抑制率24 h 48 h 72 h 0 nmol/L 5.34± 3.20 10.13± 2.50 21.50± 4.80 2 nmol/L 30.80±37.20* 43.60±10.70*# 70.33±32.50*#@10 nmol/L 57.40±10.80*a 71.17±26.50*a# 82.37±37.60*a#@50 nmol/L 71.23±25.40*ab 83.40±31.80*ab# 85.14±36.50*ab#@

表2 不同濃度硼替佐米對DC表面共刺激分子表達的影響(%，±s)

表2 不同濃度硼替佐米對DC表面共刺激分子表達的影響(%，±s)

注:與 LPS比較，*P ＜0.05。

CD40 CD80 CD86 MHCII處理因素LPS 68.19±13.50 78.02±18.70 73.01±20.40 86.94±18.40 LPS+2 nmol/L硼替佐米 62.14±10.20 72.39±16.20 68.56±15.90 72.51±19.30*LPS+10 nmol/L硼替佐米 48.82± 9.30*47.21±13.60*42.52±10.60*68.31±20.43*LPS+50 nmol/L硼替佐米 22.03± 5.90*35.19±10.10*34.31± 6.40*35.65±12.50*

2.3 不同濃度硼替佐米處理的DC培養(yǎng)上清中TNF-α與IL-12水平比較 見表3。

表3 不同濃度硼替佐米處理的DC培養(yǎng)上清中TNF-α與 IL-12 水平比較(pg/mL，±s)

表3 不同濃度硼替佐米處理的DC培養(yǎng)上清中TNF-α與 IL-12 水平比較(pg/mL，±s)

注:與空白對照及LPS+0 nmol/L硼替佐米比較，*P＜0.05。

處理因素 IL-12 TNF-α 72.30± 15.70 100.09±30.60 LPS+0 nmol/L硼替佐米 467.90±132.20 814.47±93.40 LPS+2 nmol/L硼替佐米 458.54±106.40 688.22±73.60*LPS+10 nmol/L硼替佐米 121.57± 49.60* 376.56±99.90*LPS+50 nmol/L硼替佐米 22.95± 11.80* 85.69±26.80空白對照*

2.4 不同濃度硼替佐米處理的MLR培養(yǎng)上清INF-γ、TNF-α水平比較 見表4。

表4 不同濃度硼替佐米處理的MLR培養(yǎng)上清INF-γ、TNF-α 水平比較(pg/mL，±s)

表4 不同濃度硼替佐米處理的MLR培養(yǎng)上清INF-γ、TNF-α 水平比較(pg/mL，±s)

注:與空白對照及LPS+0 nmol/L硼替佐米比較，*P＜0.05。

處理因素 INF-γ TNF-α 13.67± 5.80 38.27± 10.50 LPS+0 nmol/L硼替佐米 276.58±60.20 574.38±107.20 LPS+2 nmol/L硼替佐米 248.32±56.40 432.57±112.50*LPS+10 nmol/L硼替佐米 196.25±73.58* 407.59± 3.40*LPS+50 nmol/L硼替佐米 68.78±26.60* 350.69± 72.60空白對照*

2.5 不同濃度硼替佐米處理的DC對異基因淋巴細胞增殖能力的影響 LPS、LPS+2 nmol/L硼替佐米、LPS+10 nmol/L硼替佐米、LPS+50 nmol/L硼替佐米處理 MLR后，3H-TdR摻入量分別為(16 843.45 ±720.50)、(14 032.36 ±716.20)、(10 341.56±538.27)、(5472.27±218.34)cpm。與單獨LPS比較，其他處理方式均導致3H-TdR摻入量減少，呈濃度依賴性(P均＜0.05)。

2.6 不同濃度硼替佐米對受DCNF-κB入核活性的影響 見圖1。經過硼替佐米預處理的imDC在LPS刺激條件下NF-κB入核量減少，并且呈現(xiàn)出濃度依賴性。

圖1 EMSA法檢測NF-κB入核活性

3 討論

DC是目前已知體內最重要的抗原遞呈細胞，而且也是惟一能激活初始型T細胞的抗原遞呈細胞，在特異性免疫應答的誘導中具有獨特地位［2］。im-DC位于組織和周圍淋巴器官，監(jiān)視和識別外源性和內源性抗原，并通過吞噬、微吞飲和胞吞作用獲取抗原。攝取抗原后，imDC經歷成熟過程，并且向周圍淋巴器官遷移。在引流淋巴器官中，負載抗原的DC通過 MHCⅡ-抗原肽-TCR復合物活化初始 T細胞［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，硼替佐米能夠抑制DC的生長，并且隨著劑量的增加及作用時間的延長，這種抑制效應也增強，呈時間、劑量依賴性。

眾所周知，T細胞的活化需兩個信號:第一信號由TCR識別APC表面的抗原肽-MHC復合物所啟動;第二信號由T細胞和APC間共刺激分子的相互作用所啟動。兩個信號的整合才可能有效地誘導T細胞活化，而缺乏共刺激信號可致T細胞應答下降，某些情況下可誘導耐受或T細胞失能［4，5］。骨髓來源的前體細胞在GM-CSF和IL-4條件下培育6 d分化成imDC，imDC可以在LPS作用下誘導成成熟DC。DC的成熟伴隨抗原遞呈分子MHCⅡ類分子和共刺激分子CD40、CD80、CD86的表達上調，黏附分子和趨化因子也能部分上調表達。本研究結果發(fā)現(xiàn)，骨髓源培養(yǎng)的DC經LPS刺激后共刺激分子(CD40、CD80、CD86)高表達，產生成熟的DC。但如果在培養(yǎng)的第6天中加入硼替佐米共育，則DC的成熟將受到抑制，表現(xiàn)為共刺激分子及MHCⅡ類分子表達下調。

DC受到病原微生物等抗原刺激后，除攝取并遞呈該抗原外，還能迅速產生并分泌大量的IL-12、TNF-α等細胞因子。IL-12作為信號分子可以促使CD+4T細胞向Th1細胞分化，從而啟動了對移植物抗宿主病(GVHD)靶器官的損傷。而TNF-α是GVHD細胞因子網絡的重要成員，除可直接引起對宿主組織的損傷外，同時能增強DC表面MHC分子和黏附分子的表達，從而大大增強供者T細胞的活化。我們發(fā)現(xiàn)，DC與不同濃度的硼替佐米共育后，其培養(yǎng)上清IL-12、TNF-α表達量降低。表明硼替佐米抑制了DC分泌細胞因子的功能。對于硼替佐米是否能影響DC活化異基因淋巴細胞的能力，我們進行了探討，結果發(fā)現(xiàn)經硼替佐米預處理后的DC與異基因淋巴細胞進行混合淋巴細胞培養(yǎng)后，異基因淋巴細胞的增殖能力明顯減弱，而培養(yǎng)上清內，異基因淋巴細胞分泌的TNF-α、INF-γ表達量也降低。說明由于硼替佐米抑制了DC表面共刺激分子的表達，第二信號缺失，從而影響異基因淋巴細胞充分活化增殖。

NF-κB作為核轉錄因子，在DC的發(fā)育、成熟與調節(jié)其免疫功能方面發(fā)揮重要作用。而之前有文獻報道，硼替佐米治療多發(fā)性骨髓瘤的機制之一即以時間和劑量依賴方式阻斷IκBα的降解，抑制NF-κB活性。也有文獻報道，一些免疫抑制劑可通過抑制NF-κB途徑抑制DC功能。所以我們推測，硼替佐米可能也會抑制DC中NF-κB通路，從而抑制DC的功能。本實驗結果證實了這個猜想，當經過硼替佐米預處理的imDC在加入LPS后，其NF-κB入核水平隨著硼替佐米濃度不斷升高而降低。

綜上所述，蛋白酶體抑制劑硼替佐米能夠通過抑制小鼠骨髓來源的DC內NF-κB的核轉移，影響其生長，抵抗LPS誘導的DC成熟，使DC表面共刺激分子的表達減少;同時，硼替佐米也能減弱DC的抗原遞呈能力，從而抑制了DC對異基因淋巴細胞的作用。

［1］Inaba K，Inaba M，Romani H，et al.Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor［J］.J Exp Med，1992，176(6):1693-1702.

［2］Reis E，Sousa C.Activation of dendritic cells:Translating innate into adaptive immunity［J］.Curr Opin Immunol，2004，16(1):21-25.

［3］Liu YJ.Dendritic cell subsets and lineages，and their functions in innate and adaptive immunity［J］.Cell，2001，106(3):259-262.

［4］Chen X，Murakami T，Oppenheim JJ，et al.Triptolide，a constituent of immunosuppressive Chinese herbal medicine，is a potent suppressor of dendritic-cell maturation and trafficking［J］.Blood，2005，106(7):2409-2416.

［5］Geoffrey RH，Takanori T，Vivienne I，et al.The p55 TNF-α receptor plays a critical role in T cell alloreactivity［J］.J Immunol，2000，164(2):656-663.