賈佳，趙堪興

(1天津市第五中心醫(yī)院，天津300450;2天津市眼科醫(yī)院)

α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸(AMPA)受體是離子型谷氨酸受體中重要的亞型，在中樞神經系統(tǒng)(CNS)內主要介導快速的興奮性突觸傳遞，在長時程增強(LTP)、長時程抑制(LTD)和學習記憶等方面均具有重要作用［1］。研究認為，無AMPA受體表達的沉默突觸激活轉化為表達AMPA受體的功能性突觸是LTP形成的重要機制［2，3］。AMPA受體的表達隨視覺發(fā)育的不同時期而發(fā)生變化，早期異常視覺經驗亦影響AMPA受體的表達，但不同的干預措施對于AMPA受體表達的影響也存在差異。本研究于2008年10月～2009年1月觀察大鼠從出生后7 d到視覺發(fā)育關鍵期結束(45 d)視皮層Ⅱ/Ⅲ層AMPA受體GluR2/3的表達變化以及單眼形覺剝奪(MD)對大鼠視皮層GluR2/3表達的影響，探討AMPA受體在視覺可塑性中的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型建立 40只健康新生(產后4～5 d)Wistar大鼠，雌雄不限，平均體質量9.4 g，均在自然光線環(huán)境下飼養(yǎng)。大鼠隨機分為對照組25只、MD組15只。MD組大鼠于生后14 d，固定，點表麻藥，剪除右眼瞼緣周圍毛發(fā)，碘伏消毒上下眼瞼局部皮膚，距上下瞼緣各1.0 mm處剪去皮膚和瞼板組織，用6-0絲線間斷縫合上下眼瞼約3～4針。術后1周內每天涂抗生素眼膏，檢查創(chuàng)口情況，避免感染及縫線脫落。約1周創(chuàng)口愈合，上下眼瞼粘連，MD模型建立成功。

1.2 動物腦組織取材 實驗大鼠稱重后用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射，麻醉滿意后，仰臥固定四肢，剪開胸腔將胸壁抬起，暴露心臟及升主動脈，將灌注針頭由心尖部導入升主動脈，固定，在右心耳處剪一小洞，先用0.01 mol/L的PBS灌洗至溢出液變清，然后用4%多聚甲醛(1 mL/g)全身灌注固定(前2/3體積快灌、后1/3體積慢灌)。打開顱骨，切取大鼠腦組織，放入4%多聚甲醛溶液，4℃冰箱固定過夜，轉移至30%蔗糖溶液中脫水，4℃至沉底，再重復脫水1次。對照組分別于生后7、14、21、28、45 d，MD組縫合右眼后繼續(xù)飼養(yǎng)至出生后21、28、45 d，各取5只多聚甲醛全身灌注后切取腦組織固定、脫水。

1.3 視皮層GluR2/3表達檢測 將脫水后的組織塊根據《大鼠腦立體定位圖譜》切取正常大鼠視皮質部分，OCT包埋，固定于-20℃恒冷箱，冷凍切片機切片，片厚12 μm，每只大鼠視皮層切片5張。如不能立即進行染色，切片置于-20℃冰箱中存放。采用熒光免疫組化染色法，嚴格按照試劑盒說明書操作，陰性對照用PBS代替一抗。采用Nikon TE2000-U倒置熒光顯微鏡下觀察，用Olympus顯微攝像系統(tǒng)采集圖片。顯微鏡為200倍時將亮度調節(jié)定位于初級視皮層Ⅱ/Ⅲ層，在相同放大倍數(shù)及相同光強度條件下采集圖像。用Image-proplus 6.0專業(yè)圖像分析軟件，記錄視皮層17區(qū)Ⅱ/Ⅲ層GluR2/3的陽性細胞(手工計數(shù))、陽性面積(area)和累積吸光度值(IOD)，計算平均吸光度(AOD)值=IOD/area。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

鏡下觀察可見，GluR2/3陽性反應物呈綠色熒光，在大鼠皮層組織廣泛分布。視皮層17區(qū)各層可見不同密度的陽性細胞分布，Ⅰ層幾乎未見明顯陽性細胞，Ⅱ/Ⅲ層分布較密集，Ⅳ、Ⅴ及Ⅵ層中等密度。陽性部位主要位于細胞膜及部分胞質。兩組大鼠出生后 7、14、21、28、45 d 視皮層Ⅱ/Ⅲ層內GluR2/3表達水平比較見表1。對照組大鼠視皮層Ⅱ/Ⅲ層GluR2/3陽性細胞數(shù)、AOD值14 d最小，與7 d比較差異無統(tǒng)計學意義(P均＞0.05)，與21、28、45 d比較差異有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)，14～45 d陽性細胞數(shù)、AOD值逐漸增加。MD組21、28、45 d陽性細胞數(shù)及AOD值呈遞增趨勢，但與對照組比較均明顯下降(P均＜0.05)。

表1 兩組大鼠不同時間視皮層Ⅱ/Ⅲ層GluR2/3表達水平比較(±s)

表1 兩組大鼠不同時間視皮層Ⅱ/Ⅲ層GluR2/3表達水平比較(±s)

注:與同組14 d比較，#P＜0.05;與對照組同時點比較，*P＜0.05。

組別 n陽性細胞數(shù)(個/視野)7 d 14 d 21 d 28 d 45 d對照組 5 143.13±9.53 135.20±9.47 150.40±8.19# 154.40±10.23# 164.93±9.14#MD組 5 - - 140.13±11.06* 141.27±8.70* 145.13±8.47*組別 n 陽性細胞AOD值7 d 14 d 21 d 28 d 45 d對照組 5 0.054 5±0.010 7 0.065 5±0.011 8 0.084 8±0.011 4# 0.096 7±0.014 7# 0.105 1±0.015 2#MD組 5 - - 0.065 6±0.012 0* 0.081 3±0.011 1* 0.089 3±0.013 7*

3 討論

Rumpel等［4］發(fā)現(xiàn)，大鼠生后發(fā)育早期視皮層內存在一定比例的沉默突觸，但只含有功能性N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體，未檢測到AMPA受體反應。隨著發(fā)育，AMPA受體逐漸插入突觸內，導致沉默突觸轉變?yōu)楣δ苄酝挥|。相對于NMDA受體的穩(wěn)定，突觸后膜上的AMPA受體的狀態(tài)和數(shù)目高度可變［1］，這種動態(tài)變化對于調節(jié)突觸傳遞效能具有十分重要的作用，而傳遞效能的變化是突觸可塑性的主要表現(xiàn)，因此AMPA受體在介導突觸可塑性方面具有重要作用。Gordon等［5］觀察貓視皮層及海馬神經元AMPA受體的表達，在生后7～42 d二者AMPA受體的表達均逐漸增高，從42 d至成熟期表達下降，但不明顯。Smith等［6］研究表明，雪貂生后視皮層GluR1含量較低，在生后2周急劇增加，2～3周達最高值，然后逐漸降至成年水平。王昌鵬等［7］研究發(fā)現(xiàn)，GluR2陽性神經元數(shù)量在大鼠生后5周時達頂峰，隨后保持穩(wěn)定水平;GluR2免疫反應的AOD值也隨發(fā)育逐漸增加，生后6周時達頂峰，隨后保持穩(wěn)定水平。王昌鵬等［8］采用腦片膜片鉗全細胞記錄技術記錄生后3～8周正常大鼠視皮層AMPA受體介導的興奮性突觸后電流，生后3～6周AMPA受體電流的幅值隨發(fā)育時間逐漸增加，6～8周幅值變化不顯著。由此推測，突觸后AMPA受體的功能變化可能參與了視覺發(fā)育可塑性關鍵期的終止過程，包含GluR2亞基的AMPA受體可能代表一種成熟的興奮性突觸后受體，在視覺發(fā)育可塑性關鍵期終止前插入未成熟突觸內，促進突觸穩(wěn)定，關鍵期終止后到成年階段，維持突觸結構穩(wěn)定并介導穩(wěn)定的興奮性突觸傳遞。本研究發(fā)現(xiàn)，生后7 d至關鍵期結束大鼠陽性細胞數(shù)、AOD值隨年齡增長呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢。隨著年齡增長，視覺通路各級神經元及神經纖維逐漸發(fā)育，神經元間的聯(lián)系逐漸增強，神經纖維對視覺刺激的反應逐漸同步，突觸遞質的釋放逐步集中，GluR2/3的表達也逐步增加，直至視覺發(fā)育關鍵期末，視覺神經系統(tǒng)已基本發(fā)育成熟，突觸聯(lián)系已基本建立，并且達到一種相對穩(wěn)定的狀態(tài)。

AMPA受體的表達受早期視覺經驗的影響，但不同的干預措施對于AMPA受體表達的影響也存在差異。Rossner等［9］觀察正常幼年大鼠視皮層AMPA受體亞單位的mRNA表達，發(fā)現(xiàn)GluR1低于成年水平，而GluR2～GluR4均高于成年水平，單眼剝奪對GluR4無影響，而GluR1～GluR3均有不同程度下降。Kumar等［10］采用放射性自顯影方法定量觀察大鼠視皮層AMPA結合位點，發(fā)現(xiàn)其從出生至生后20 d表達增加，而單眼剝奪引起視皮層Ⅱ～Ⅵ層AMPA受體表達減少。Wrong-Riley等［11］研究證實，初級視皮層Ⅱ/Ⅲ和Ⅵ層GluR2的表達受視覺輸入及神經元活性影響，單眼輸入阻滯可引起剝奪眼優(yōu)勢柱及GluR2的下調。孫曉楠等［12］研究表明，敏感期內形覺剝奪組SD大鼠視皮層AMPAGluR2的蛋白表達及mRNA均較對照組下降。本研究觀察的3個時段MD組大鼠視皮層Ⅱ/Ⅲ層內GluR2/3陽性細胞數(shù)量及AOD值較正常對照組均明顯下降，與上述研究結果一致。由此可見，異常的視覺經驗可以影響GluR2/3的正常表達;但形覺剝奪后(出生后21～45 d)GluR2/3的表達仍呈現(xiàn)遞增趨勢，由此推測，形覺剝奪僅能部分影響GluR2/3的表達，但并不能完全阻斷GluR2/3增多的趨勢。

綜上所述，在視覺發(fā)育關鍵期內大鼠GluR2/3的表達同時受年齡及視覺經驗雙重因素的影響與調控。但視覺經驗是通過何種途徑影響AMPA受體的表達以及AMPA受體在視覺可塑性及弱視發(fā)病中的具體作用機制有待進一步研究。

［1］Song I，Huganir RL.Regulation of AMPA receptors during synaptic plasticity［J］.Trends Neurosci，2002(25):578-588.

［2］Liao D，Scannevin RH，Huganir R.Activation of silent synapses by rapid activity-dependent synaptic recruitment of AMPA receptors［J］.Neurosci，2001，21(16):6008-6017.

［3］Montgomery JM，Pavlidis P，Madison DV.Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation［J］.Neuron，2001，29(3):691-701.

［4］Rumpel S，Kattenstroth G，Gottmann K.Silent synapses in the immature visual cortex:layer-specific developmental regulation［J］.Neurophysiol，2004，91(2):1097-1101.

［5］Gordon B，Tseng YL，Jaeger R，et al.The development of MK-801，kainate，AMPA，and muscimol binding sites in cat visual cortex［J］.Vis Neurosci，1995，12(2):241-252.

［6］Smith AL，Thompson ID.Distinct laminar differences in the distribution of excitatory amino acid receptors in adult ferret primary visual cortex［J］.Neuroscience，1994，61(3):467-479.

［7］王昌鵬，陰正勤，秦偉，等.大鼠視覺發(fā)育可塑性關鍵期終止前后視皮層神經元AMPA受體GluR2亞基表達的變化［J］.眼科新進展，2008，28(7):481-485.

［8］王昌鵬，陰正勤，秦偉，等.大鼠視覺發(fā)育可塑性關鍵期終止前后視皮層AMPA受體電流的發(fā)育變化［J］.眼科新進展，2008，28(9):641-645.

［9］Rossner S，Kumar A，Kues W，et al.Differential laminar expression of AMPA receptor genes in the developing rat visual cortex using in situ hybridization histochemistry.Effect of visual deprivation［J］.Int J Dev Neurosci，1993，11(4):411-424.

［10］Kumar A，Schliebs R，Bigl V.Postnatal development of NMDA，AMPA，and kainate receptors in individual layers of rat visual cortex and the effect of monocular deprivation［J］.Int J Dev Neurosci，1994，12(1):31-41.

［11］Wong-Riley MT，Jacobs P.AMPA glutamate receptor subunit 2 in normal and visually deprived macaque visual cortex［J］.Vis Neurosci，2002，19(5):563-573.

［12］孫曉楠，陶軍，郝旭紅，等.左旋多巴及胞二磷膽堿對單眼形覺剝奪大鼠視皮質 α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸 GluR2表達的影響［J］.中華實驗眼科雜志，2012，30(12):1065-1069.