李凌浩，王智，陸時(shí)運(yùn)，趙曉紅，周仲昊，王晨

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫第二醫(yī)院，江蘇無錫214002)

Wilms基因(WT1)最早于1990年由 Call等［1］在Wilms瘤中發(fā)現(xiàn)，其定位于人類染色體11p13，編碼產(chǎn)物為一鋅指轉(zhuǎn)錄因子。近年研究發(fā)現(xiàn)，WT1可調(diào)控造血細(xì)胞增生和(或)分化基因的轉(zhuǎn)錄或激活，與急性髓系白血病(AML)等多種腫瘤性疾病密切相關(guān)。近年來，WT1在AML患者中的表達(dá)及其與疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的關(guān)系受到廣泛關(guān)注。2010年1月～2013年12月，我們觀察了AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中WT1表達(dá)水平，并分析其與患者臨床特征、療效及預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 同期選擇我院收治的初發(fā)AML患者56例，男30例、女26例，年齡23～85歲。同期另選非腫瘤患者28例，男17例、女11例，年齡34～78歲，其中營養(yǎng)性貧血12例、感染8例、免疫性血小板減少性紫癜8例。兩組性別、年齡具有可比性。所有研究對象符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》［2］中的相應(yīng)診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 WT1檢測 收集所有研究對象的抗凝骨髓液2 mL，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液處理后得到單個(gè)核細(xì)胞，TRIzol液裂解，提取總RNA，經(jīng)分光光度儀定量調(diào)整RNA 濃度至 0.5 μg/μL。合成 cDNA:配置 40 μL反應(yīng)體系:隨機(jī)引物 2 μL、RNA 4 μL、5 × Buffer液8 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶 1.5 μL、RNA 酶抑制劑 0.6 μL、dNTP 0.5 μL、DEPC 水 23.4 μL，混勻后置于 PCR儀內(nèi)，反應(yīng)條件:37℃ 1 h、95℃ 5 min、4℃長期，得到cDNA產(chǎn)物。采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(QTPCR)，所有引物和探針由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。根據(jù)文獻(xiàn)［3］設(shè)計(jì)WT1、ABL基因引物和探針及設(shè)置反應(yīng)條件，將WT1、ABL基因已知陽性模板進(jìn)行倍比稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測樣本中各基因量根據(jù)其CT值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出，每份標(biāo)本檢測3次取平均值，以WT1拷貝數(shù)/10 000ABL拷貝數(shù)作為待測標(biāo)本W(wǎng)T1基因表達(dá)量。判定標(biāo)準(zhǔn):WT1參照歐洲白血病網(wǎng)標(biāo)準(zhǔn)［4］，以250拷貝數(shù)/10 000 ABL拷貝數(shù)為界分為高表達(dá)組和正常表達(dá)組。

1.3 治療方案及效果評價(jià) 所有初診AML患者接受標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)緩解化療方案，包括DA方案(柔紅霉素45 mg/m2第1～3天，阿糖胞苷150 mg/m2第1～7天)或IA方案(去甲氧柔紅霉素8 mg/m2第1～3天，阿糖胞苷150 mg/m2第1～7天)。參照文獻(xiàn)［2］評價(jià)療效，包括完全緩解(CR)、無事件生存(EFS)時(shí)間、總生存(OS)時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS8.1統(tǒng)計(jì)軟件。EFS、OS比較采用Wilcoxon檢驗(yàn)，CR率比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AML與非腫瘤患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中WT1表達(dá)水平比較 56例AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中WT1表達(dá)水平為(10～19 733)拷貝/10 000 ABL拷貝，中位數(shù)為2 875拷貝/10 000 ABL拷貝;高表達(dá)48例，正常表達(dá)8例。28例非腫瘤患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中WT1表達(dá)水平全部＜10拷貝/10 000 ABL拷貝，中位數(shù)為8拷貝/10 000 ABL拷貝;無高表達(dá)病例。AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中WT1表達(dá)水平明顯高于非腫瘤患者(P＜0.01)

2.2 不同WT1表達(dá)的AML患者臨床特征 不同WT1表達(dá)水平的AML患者年齡、外周血白細(xì)胞數(shù)量、骨髓原幼細(xì)胞比例、LDH水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 不同WT1表達(dá)水平AML患者臨床特征［中位數(shù)(95%CI)］

2.3 AML患者WT1表達(dá)水平與其他臨床指標(biāo)的關(guān)系 見表2。

表2 不同WT1表達(dá)水平AML患者臨床指標(biāo)比較(例)

2.4 AML患者不同WT1表達(dá)水平與療效及預(yù)后關(guān)系 首次誘導(dǎo)化療后，正常表達(dá)組CR 6例，高表達(dá)組CR 31例，兩組CR率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。正常表達(dá)組EFS時(shí)間3～33個(gè)月、中位EFS時(shí)間22個(gè)月，高表達(dá)組EFS時(shí)間0.5～35個(gè)月、中位EFS時(shí)間15個(gè)月，兩組EFS時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。正常表達(dá)組OS時(shí)間7～38個(gè)月、中位OS時(shí)間29.5個(gè)月，高表達(dá)組OS時(shí)間1～40個(gè)月、中位OS時(shí)間19個(gè)月，兩組OS時(shí)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

研究顯示，WT1具有增強(qiáng)或抑制目的基因轉(zhuǎn)錄的作用，其目的基因可進(jìn)一步參與細(xì)胞的生長及分化。最初 WT1被作為一種抑癌基因，但近年在AML的研究中發(fā)現(xiàn)，其具有致癌作用［5］，目前已作為一種新的AML指標(biāo)被人們關(guān)注。

研究顯示，AML患者普遍存在WT1高表達(dá)。本研究中，AML患者WT1表達(dá)水平明顯高于非腫瘤患者，AML患者中WT1高表達(dá)者占85.7%(48/56)，與以往報(bào)道一致。研究結(jié)果顯示，WT1表達(dá)水平的高低與患者性別、年齡、外周血白細(xì)胞數(shù)量、骨髓原幼細(xì)胞比例無關(guān)，與Yang等［5］報(bào)道一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，WT1表達(dá)水平的高低與血清LDH水平亦無相關(guān)性，提示其為一種獨(dú)立于以上指標(biāo)的新的AML臨床指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，WT1表達(dá)正常者與WT1高表達(dá)AML患者首次誘導(dǎo)化療后CR率相當(dāng)，但WT1表達(dá)正常AML患者EFS、OS時(shí)間更長。提示AML骨髓單個(gè)核細(xì)胞中WT1表達(dá)正常者可能獲得更好的療效和預(yù)后。目前，有關(guān)WT1表達(dá)水平與AML患者療效間的關(guān)系尚存在爭議，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為WT1高表達(dá)者預(yù)后較差［6～12］，也有學(xué)者認(rèn)為 WT1表達(dá)水平對預(yù)后無指導(dǎo)意義或預(yù)后較好［13～15］。關(guān)于WT1在AML中預(yù)后意義的不同研究結(jié)果可能與患者數(shù)量、多種其他預(yù)后因素影響、WT1基因突變及眾多WT1亞型等復(fù)雜因素有關(guān)，其能否成為AML的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)還有待商榷。

綜上所述，AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞WT1水平較非腫瘤患者明顯高表達(dá);AML患者WT1表達(dá)水平與患者性別、年齡、外周血白細(xì)胞數(shù)量、骨髓原幼細(xì)胞比例、血清LDH水平無關(guān)，可能與療效、EFS時(shí)間、OS時(shí)間有關(guān)，尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量加以驗(yàn)證。

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