湯喻，史祖宣

(河南省人民醫(yī)院，鄭州450003)

人工合成的胰島素及類似物臨床廣泛用于2型糖尿病的治療，通過激活胰島素受體(IR)、胰島素生長因子受體1(IGF-1R)及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶 B(Akt)通路發(fā)揮調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝和促有絲分裂作用。有研究發(fā)現(xiàn)，IR、IGF-1R及MAPK、PI3K/Akt信號通路的異?？赡茉谀承┠[瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用［1］;而不同的胰島素及類似物對乳腺癌、肝癌、結腸癌等腫瘤細胞可產(chǎn)生促進或抑制增殖的作用［2，3］，但其在乳腺癌細胞增殖中的作用研究較少。2010～2014年我們比較了甘精胰島素和地特胰島素對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響。報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7細胞株購于中科院上海生科院細胞庫。甘精胰島素由賽諾菲(北京)制藥有限公司提供，地特胰島素由諾和諾德(中國)制藥有限公司提供。MTT試劑盒、碘化丙啶(PI)、MAPKK1抑制劑PD98059、PI3K抑制劑LY294002、Akt、磷酸化 Akt(p-Akt)(ser473)、Erk1/2、磷酸化Erk1/2(p-Erk1/2)抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白G均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存細胞1支，迅速置于37℃水浴中，并輕輕搖動令其內(nèi)容盡快融化。待細胞懸液融化，消毒管口，超凈臺內(nèi)打開凍存管蓋，用吸管吸出細胞懸液移至離心管中，補加1 mL含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，吹打使細胞懸浮。室溫，1 500 r/min，離心 3 min，棄上清，重新加入 1 mL含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，吹打重懸細胞，接種至培養(yǎng)瓶中，補足含10%FBS的 RPMI 1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中松蓋培養(yǎng)。次日換液1次，以后根據(jù)細胞生長狀態(tài)1～3 d換液。吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入1～2 mL 0.25%的胰蛋白酶液靜置3～5 min，加入含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液。用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液。吸取少許細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，加適量含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液于接種了細胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日換液1次，以后根據(jù)細胞生長狀態(tài)1～3 d換液。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 細胞增殖檢測 采用MTT法。取對數(shù)生長期細胞，以3×103個/孔接種于96孔板，并貼壁培養(yǎng)24 h。行以下處理:①1 U/L甘精胰島素或地特胰島素作用24、48、72、96 h;②10、100、1 000 U/L 甘精胰島素或地特胰島素作用48 h;③1 U/L甘精胰島素 +20 μmol/L PD98059、1 U/L 甘精胰島素 +10 μmol/L LY2904002作用48 h。以上均設正常對照組。每孔加入MTT液10 μL，培養(yǎng)4 h。吸棄孔內(nèi)液體，加入二甲基亞砜(DMSO)100 μL，震蕩搖勻10 min，酶標儀于490 nm處測各孔吸光度值(OD值)計算細胞增殖活力。

1.4 細胞周期檢測 采用流式細胞儀檢測。細胞以8×104個/孔接種于6孔板，并貼壁培養(yǎng)48 h，10 U/L甘精胰島素或地特胰島素作用24 h，設立正常對照組。收集細胞，PBS洗2次，離心后的細胞沉淀用300 μL PBS重懸，逐滴加入700 μL無水乙醇，4℃避光過夜。PBS洗2次，PI染液染色，4℃避光30 min，流式細胞儀測細胞周期。

1.5 Erk1/2、Akt磷酸化程度檢測 采用Western blotting法。細胞以8×104個/孔接種于6孔板，貼壁48 h，10 U/L甘精胰島素或地特胰島素作用24 h，設立正常對照組。提取蛋白，BCA法測蛋白濃度，蛋白濃度調(diào)至4.0 μg/μL，5 ×上樣緩沖液混合，沸水煮10 min，冷卻后25 μL上樣，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉2 h，一抗搖床4℃孵育過夜，洗膜3次后二抗孵育1 h。洗膜3次后DAB顯色。采用VisionWorkLS軟件分析磷酸化程度。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組定量資料比較用單因素方差分析或Kruskal-Wallis秩和檢驗，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同作用時間甘精胰島素、地特胰島素對MCF-7細胞增殖的影響 1 U/L甘精胰島素或地特胰島素作用24 h均未引起MCF-7細胞增殖;1 U/L甘精胰島素作用48、72、96 h均引起MCF-7細胞增殖，呈時間依賴關系(P＜0.05);地特胰島素增殖作用不明顯。見表1。

表1 1 U/L甘精胰島素、地特胰島素作用MCF-7細胞24、48、72、96 h增殖水平比較(±s)

表1 1 U/L甘精胰島素、地特胰島素作用MCF-7細胞24、48、72、96 h增殖水平比較(±s)

注:與對照組同時點比較，*P＜0.05;與地特胰島素組同時點比較，#P＜0.05;與同組96 h比較，△P＜0.05。

組別細胞增殖活力24 h 48 h 72 h 96 h對照組 0.233 4±0.011 4 0.237 3±0.010 5 0.301 7±0.014 50.315 5±0.022 0地特胰島素組 0.217 2±0.010 5 0.251 1±0.010 2 0.309 3±0.014 7 0.347 3±0.039 9甘精胰島素組 0.222 8±0.010 6 0.302 9±0.012 9*#△ 0.372 2±0.015 1*#△ 0.456 7±0.025 1*#

2.2 不同濃度甘精胰島素或地特胰島素對MCF-7細胞增殖的影響 培養(yǎng)48 h后，甘精胰島素10、100、1 000 U/L均引起MCF-7細胞增殖，呈濃度依賴關系(P＜0.05);地特胰島素則增殖作用不明顯。見表2。

表2 不同濃度甘精胰島素、地特胰島素作用MCF-7細胞48 h 增殖水平比較(±s)

表2 不同濃度甘精胰島素、地特胰島素作用MCF-7細胞48 h 增殖水平比較(±s)

注:與對照組同濃度比較，*P＜0.05;與地特胰島素組同濃度比較，#P＜0.05;與同組1 000 U/L比較，△P＜0.05。

組別胰島素細胞增殖活力10 U/L胰島素 100 U/L胰島素 1 000 U/L對照組0.195 7±0.006 5 0.195 7±0.006 5 0.195 7±0.006 5地特胰島素組 0.206 6±0.007 6 0.215 7±0.007 6 0.226 2±0.007 3甘精胰島素組 0.259 2±0.007 2*#△0.267 2±0.006 9*#△0.300 7±0.017 9*#

2.3 10 U/L甘精胰島素或地特胰島素作用MCF-7細胞24 h細胞周期變化 對照組S+G2/M期細胞(27.316 7±5.597 7)%、地特胰島素組S+G2/M期細胞(30.036 7±2.707 1)%、甘精胰島素組S+G2/M期細胞(37.996 7±6.278 1)，甘精胰島素組反映增殖活性的S+G2/M期細胞明顯高于對照組(P＜0.05)，而地特胰島素對細胞增殖作用不明顯。

2.4 10 U/L甘精胰島素、地特胰島素作用MCF-7細胞24 h Erk1/2和Akt磷酸化程度 對照組Erk、Akt磷酸化程度分別為(44.41±5.97)%、(47.78±1.09)%，地特胰島素組分別為(54.27±10.06)%、(51.63±2.02)%，甘精胰島素組分別為(66.07±5.20)%、(56.53±4.37)%。甘精胰島素組MCF-7細胞Erk1/2、Akt磷酸化程度較對照組升高(P均＜0.05)，而地特胰島素組升高不明顯。

2.5 1 U/L甘精胰島素聯(lián)合抑制劑作用MCF-7細胞48 h細胞生長情況 MCF-7細胞中，1 U/L甘精胰島素+PD98059、1 U/L甘精胰島素 +LY294002作用MCF-7細胞48 h，其細胞OD值分別為0.175 0±0.002 3、0.192 0 ±0.001 6，明顯少于甘精胰島素組、對照組(0.242 4±0.007 7、0.203 4±0.003 8，P均＜0.05)，但甘精胰島素+PD98059組細胞數(shù)目減少更明顯(P＜0.05)。

3 討論

MAPK和PI3K/Akt/mTOR信號通路是人體內(nèi)重要的信號通路，能夠促進腫瘤細胞增殖和腫瘤血管形成，抑制腫瘤細胞凋亡，增強腫瘤侵襲性，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用［4，5］。2型糖尿病患者肝癌、乳腺癌、結直腸癌、胰腺癌等腫瘤發(fā)病風險增高［6］，主要與 IR、IGF-1R 及下游 MAPK、PI3K/Akt信號通路的激活有關［1］。2型糖尿病導致胰島素抵抗和高胰島素血癥，高胰島素水平減少胰島素樣生長因子結合蛋白-1和胰島素樣生長因子結合蛋白-2，使游離的有生物活性的IGF-1增多［7］。胰島素、IGF-1激活IR、IGF-1R。IR和IGF-1R有極其相近的信號轉(zhuǎn)導通路［8］，即MAPK、PI3K/Akt信號通路，共同在高胰島素血癥下的惡性細胞增殖中發(fā)揮作用。近年來，大量研究報道2型糖尿病治療藥物二甲雙胍［9］、胰島素及類似物［2，3］、噻唑烷二酮類［10］、磺脲類［11］等可通過調(diào)節(jié)MAPK和(或)PI3K/Akt信號通路影響腫瘤細胞生長。2型糖尿病治療藥物與腫瘤風險的關系引起了高度關注。

甘精胰島素是在人胰島素B鏈C端增加2個精氨酸并用甘氨酸取代A鏈21位門冬氨酸后得到的胰島素類似物;地特胰島素是去除人胰島素B鏈30位蘇氨酸，并在B鏈29位賴氨酸上增加一個肉豆蔻酸側(cè)鏈得到的胰島素類似物。二者分子結構的不同，決定了它們對于IR、IGF-1R的親和力不同。Kurtzhals等［12］研究認為地特胰島素與IR的親和力比人胰島素稍低;地特胰島素與IGF-1R的親和力比人胰島素降低5倍，甘精胰島素與IGF-1R的親和力是人胰島素的6.5倍。因此不同的胰島素及類似物對腫瘤細胞生長的影響可能不同。經(jīng)過大規(guī)模的流行病學調(diào)查后，Hemkens等［13］報道，相同用量下甘精胰島素導致腫瘤的風險高于人胰島素。Dejgaard等［14］報道2型糖尿病患者使用地特胰島素患腫瘤的風險比使用魚精蛋白鋅胰島素或甘精胰島素者降低或相當。而乳腺癌細胞的體外實驗發(fā)現(xiàn)，甘精胰島素和地特胰島素對乳腺癌細胞株MCF-7有明顯地促進增殖作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，甘精胰島素對MCF-7細胞促增殖作用明顯，地特胰島素對細胞促增殖作用不明顯，兩藥差異有統(tǒng)計意義。二者對MCF-7細胞增殖作用的差異可能是因為兩藥對IR、IGF-1R的親和力不同。兩藥以1 U/L作用MCF-7細胞24 h，均未引起細胞增殖，但甘精胰島素以1 U/L作用48 h可以引起細胞增殖，甘精胰島素10 U/L作用24 h S+G2/M期細胞增多，證實甘精胰島素對MCF-7細胞增殖作用呈濃度、時間依賴關系。兩藥10 U/L作用24 h Erk1/2和Akt磷酸化程度增高，而地特胰島素組與對照組比較差異無統(tǒng)計意義，說明在甘精胰島素引起細胞增殖過程中，MAPK、PI3K/Akt通路均被激活。使用抑制劑后MCF-7細胞數(shù)目減少，但Erk1/2被阻斷后細胞數(shù)目減少更明顯，說明MAPK通路在甘精胰島素引起MCF-7細胞增殖的過程中發(fā)揮更為重要的作用。

綜上所述，甘精胰島素對乳腺癌MCF-7細胞增殖作用明顯，而地特胰島素增殖作用不明顯，其機制可能為二者對IR、IGF-1R親和力不同。在甘精胰島素促進MCF-7細胞增殖的過程中，MAPK和PI3K/Akt通路均被激活，但MAPK通路更重要。

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