史衛(wèi)林，李堅，陸建保，陳萍，陳康

(1溧陽市人民醫(yī)院，江蘇溧陽213300;2江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院)

近年來，腫瘤的放療技術(shù)已取得了較大進展，但仍有部分患者因放射抵抗而導(dǎo)致放療失敗，究其原因主要與腫瘤細胞對放射線耐受有關(guān)，故尋找對放療有增敏作用的藥物成為腫瘤治療領(lǐng)域研究的一個熱點?？鄥⑺厥侵兴幙鄥⒌闹饕钚猿煞种?，主要從苦參根及苦豆子中提取，具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤、抗病毒、抗心律失常等作用［1］，也有少量研究表明其有放療增敏作用［2］，但是增敏機制尚不清楚。2014年3月～2015年3月，我們觀察了苦參素對肺癌A549細胞的放療增敏作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)，苦參素標準品(北京中科儀友化工技術(shù)研究院)，CCK-8試劑盒(生工生物工程上海股份有限公司)，TRIzol試劑盒(Invitriogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量 PCR試劑盒(TaKaRa公司)，DNA PKcs兔抗人單克隆抗體(abcam公司)，β-actin鼠抗人單克隆抗體(Santa Cruz公司)，辣根過氧化物酶標記羊抗鼠/兔二抗(BD公司)，發(fā)光劑(Millipore公司)，倒置式生物顯微鏡(Olympus公司)，Clinac 600c 6MV X射線(Varian公司)，HT-2型酶標儀(Austria公司)，超聲破碎儀(Misonix公司)，蛋白電泳儀(Bio-Rad公司)，凝膠成像及分析系統(tǒng)(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)，熒光定量 PCR分析儀(Stratagene公司)，人肺腺癌細胞株 A549由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 肺癌A549細胞增殖檢測 采用CCK-8法。體外培養(yǎng)肺癌A549細胞，取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板，每孔100 μL(每孔約5×103個細胞)。培養(yǎng)12 h后移液槍小心吸取上清，將含有0.5、1.0、2.0、4.0 g/L苦參素的培養(yǎng)基100 μL加入對應(yīng)的孔(實驗組)中，同時設(shè)立空白組和陰性對照組，每孔設(shè)6個復(fù)孔。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，分別在培養(yǎng)24、48 h于對應(yīng)的各孔中加CCK-8試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，在酶標儀上于450 nm處測定吸光度A值。重復(fù)測量3次，取平均值。用空白組調(diào)零后，計算各組細胞增殖率(細胞增殖率=實驗組A值/對照組A值×100%)。

1.3 Ku70 mRNA表達檢測 采用實時熒光定量RT-PCR法。根據(jù)細胞抑制率(細胞抑制率=1-細胞增殖率)，采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件計算48 h時苦參素的 IC20值，并以此作為加藥濃度［3，4］。取對數(shù)生長期肺癌A549細胞，隨機將肺癌A549細胞分為對照組、單純藥物組、單純放療組(2 Gy)、藥物聯(lián)合放療組。各組在苦參素和(或)放療干預(yù)48 h后，收集細胞，使用TRIzol試劑提取RNA，測定RNA濃度，然后進行逆轉(zhuǎn)錄，最后PCR擴增。擴增條件:95℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。GAPDH:上游引物:5＇-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3＇，下游引物:5 ＇-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3 ＇，產(chǎn)物長度172 bp;Ku70:上游引物:5 ＇-CTCTTGGCTGTGGTGTTCTATGGTA-3＇，下游引物:5＇-TGAGTGAGTAGTCAGATCCGTGGC-3＇，產(chǎn)物長度187 bp。以GAPDH作為內(nèi)參照，定量分析Ku70 mRNA的相對表達水平。計算公式

1.4 Ku70蛋白表達檢測 采用Western blotting法。分組及苦參素和(或)放療干預(yù)同1.3。各組在苦參素和(或)放療干預(yù)48 h后，裂解細胞，提取蛋白，采用蛋白試劑盒測定濃度，樣品變性，將蛋白通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉，加入稀釋的一抗4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶二抗孵育后將PVDF膜置于凝膠成像及分析系統(tǒng)暗室中，滴加ECL發(fā)光劑，曝光顯示條帶。使用Lane 1D凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)分析條帶的灰度，以Ku70/β-actin表示Ku70蛋白的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度苦參素對肺癌A549細胞增殖率的影響 A549細胞經(jīng)不同濃度苦參素處理后，細胞增殖率隨苦參素作用時間的延長及濃度的增大而下降，呈時間依賴性和劑量依賴性。4種濃度的苦參素作用后細胞增殖率見表1。

表1 不同濃度苦參素處理后A549細胞增殖率(±s)

表1 不同濃度苦參素處理后A549細胞增殖率(±s)

注:與0.5 g/L比較，*P＜0.05;與1.0 g/L比較，#P＜0.05;與2.0 g/L比較，△P＜0.05;與同濃度24 h比較，▼ P＜0.05。

細胞增殖率24 h 48 h苦參素濃度0 g/L(陰性對照組)1.000±0.000 1.000±0.000 0.5 g/L 0.908±0.036 0.892±0.039▼1.0 g/L 0.836±0.043* 0.786±0.024*▼2.0 g/L 0.651±0.060*# 0.588±0.026*#▼4.0 g/L 0.375 ±0.098*#△ 0.297 ±0.149*#△▼

2.2 各組肺癌A549細胞Ku70 mRNA及蛋白表達水平比較 肺癌A549細胞經(jīng)苦參素處理后48 h的IC20值為0.9 g/L。以此為加藥濃度，各組干預(yù)48 h后Ku70 mRNA及蛋白表達比較見表2。單純放療組中Ku70 mRNA及蛋白的相對表達水平與對照組比較明顯增高(P＜0.05)。單純藥物組、藥物聯(lián)合放療組的Ku70 mRNA及蛋白相對表達水平均明顯低于同等照射劑量的對照組及單純放療組(P＜0.01)。

表2 各組A549細胞處理48 h時Ku70 mRNA及蛋白的相對表達水平比較(±s)

表2 各組A549細胞處理48 h時Ku70 mRNA及蛋白的相對表達水平比較(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05;與單純藥物組比較，#P＜0.05;與單純放療組比較，▼P＜0.01。

組別 n Ku70 mRNA Ku70蛋白對照組6 1.00±0.000 1.20±0.232單純放療組 6 3.64±1.147* 1.33±0.424*單純藥物組 6 0.87±0.280*▼ 0.76±0.176*▼藥物聯(lián)合放療組 6 0.64±0.265*#▼ 0.62±0.156*#▼

3 討論

DNA是放射線作用的主要靶點，放射線的直接作用和電離效應(yīng)產(chǎn)生的自由基共同導(dǎo)致DNA單、雙鏈斷裂損傷，以雙鏈斷裂損傷最為重要。當DNA雙鏈受到損傷時，細胞將通過不同的通路啟動應(yīng)答進行損傷修復(fù)。在哺乳動物細胞中，雙鏈斷裂損傷修復(fù)有兩條通路:同源重組和非同源末端連接(NHEJ)，其中NHEJ通路在雙鏈斷裂損傷修復(fù)中可能起主要作用［5］。人Ku70基因位于染色體22q13，編碼609個氨基酸，相對分子質(zhì)量為69 kD，它與Ku80通過非共價鍵緊密結(jié)合形成的異源二聚體結(jié)構(gòu)稱為Ku蛋白［6］。研究證實，Ku蛋白是DNA依賴蛋白酶(DNA-PK)復(fù)合物的主要功能單位，而DNA-PK復(fù)合物是DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)過程中的關(guān)鍵蛋白激酶，在整個NHEJ過程中具有重要作用［7］。因此，Ku70是目前研究腫瘤細胞放療敏感性的主要靶點之一。

苦參素(氧化苦參堿)是傳統(tǒng)中藥苦參的主要生物活性成分之一，來源于豆科植物苦參的干燥根。近年研究發(fā)現(xiàn)，苦參素有多方面的藥理活性，其中抗腫瘤作用受到了廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，苦參素能夠抑制腫瘤細胞增殖，引起細胞周期阻滯，促進細胞凋亡、抗腫瘤新生血管形成以及抑制腫瘤侵襲等［8］。也有研究發(fā)現(xiàn)，苦參素有放療增敏作用［2］，但增敏機制不甚清楚。本研究實驗結(jié)果亦顯示苦參素能夠抑制A549細胞的增殖，這一作用呈時間和劑量依賴性。

研究顯示，Ku70基因高表達的腫瘤細胞對放射線耐受，而低表達則高度敏感［9］。有研究表明，抑制Ku70基因和蛋白的表達可提高腫瘤細胞放射線的敏感性，反映了Ku70的表達與細胞對放射線的敏感性密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，單純放療后肺癌細胞Ku70 mRNA及蛋白的相對表達水平明顯增加，表明放射線在殺傷肺癌細胞的同時，也誘導(dǎo)了Ku70基因及蛋白的表達增加，NHEJ通路的DNA損傷修復(fù)功能被激活，以抵抗放射線對肺癌細胞的殺傷作用，也證明了Ku70在肺癌細胞對放療的耐受中具有重要作用，其表達水平可以作為預(yù)測腫瘤對放療敏感性的標志，這與 Komuro等［10］研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，單獨用苦參素處理肺癌A549細胞后Ku70 mRNA及蛋白的表達水平較對照組下降。同時苦參素聯(lián)合放射線處理肺癌A549細胞后，Ku70 mRNA及蛋白的表達較單純放射線處理明顯下調(diào)，也表明了苦參素可以抑制Ku70的表達，從而影響了DNA的修復(fù)，起到了增加放射線敏感性的作用，這也可能是其放療增敏機制之一。

綜上所述，苦參素對肺癌A549細胞具有放療增敏作用。其增敏機制可能是通過下調(diào)Ku70表達，抑制細胞DNA損傷修復(fù)功能來實現(xiàn)。

［1］黃贊松，周喜漢.苦參素藥理和抗腫瘤作用研究［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2009，15(11):1701-1704.

［2］田瑞華，陳祥明，楊雪.苦參素葡萄糖注射液聯(lián)合放療治療食管癌的臨床研究［J］.實用臨床醫(yī)藥雜志，2010，14(23):67-68.

［3］蔣曉東，戴鵬，吳瑾，等.重組人血管內(nèi)皮抑制素通過改善乏氧增強肺腺癌放射敏感性的體外實驗研究［J］.山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2011，49(12):5-9.

［4］李寧，周曉靚，施培基，等.吡啶丙烯酸衍生物的合成及放射增敏作用的研究［J］.天津醫(yī)藥，2011，39(2):153-155.

［5］Lieber MR，Ma Y，Pannicke U，et al.Mechanism and regulation of human non-homologous DNA end-joining［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2003，4(9):712-720.

［6］Doherty AJ，Jackson SP.DNA repair:how Ku makes ends meet［J］.Curr Biol，2001，11(22):920-924.

［7］Collis SJ，DeWeese TL，Jeggo PA，et al.The life and death of DNA-PK［J］.Oncogene，2005，24(6):949-961.

［8］Wu XS，Yang T，Gu J，et al.Effects of oxymatrine on the apoptosis and proliferation of gallbladder cancer cells［J］.Anticancer Drugs，2014，25(9):1007-1015.

［9］Qi D，Hu Y，Zhang Y，et al.Effect of Ku70 expression on radiosensitivity in renal carcinoma 786-O cells［J］.Cancer Cell Int，2014(14):44.

［10］Komuro Y，Watanabe T，Hosoi Y，et al.Prediction of tumor radiosensitivity in rectal carcinoma based on p53 and Ku70 expression［J］.J Exp Clin Cancer Res，2003，22(2):223-228.