范琳 王鵬 楊妍 馬俊 葛燕萍 衛(wèi)衛(wèi) 崔振玲

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·論著·

RNA恒溫擴增實時熒光檢測技術(shù)檢測支氣管肺泡灌洗液對涂陰肺結(jié)核的快速診斷價值

范琳 王鵬 楊妍 馬俊 葛燕萍 衛(wèi)衛(wèi) 崔振玲

目的 研究結(jié)核分枝桿菌RNA恒溫擴增實時熒光檢測技術(shù)(simultaneous amplification and testing forMycobacteriumtuberculosis，SAT-TB)檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)對涂陰肺結(jié)核的診斷價值。方法 對2012年6月至2014年6月收治的同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核科的252例疑似肺結(jié)核患者進行篩查，痰涂片連續(xù)3次陰性者進入研究，行支氣管鏡檢查，收集BALF，行結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)(Bactec MGIT 960)及SAT-TB檢測，同時進行診斷。所有患者隨訪至少6個月，記錄入選者的最后診斷、影像學特征、痰培養(yǎng)結(jié)果等所有相關(guān)信息。以培養(yǎng)法作為診斷的參考標準，計算SAT-TB診斷涂陰肺結(jié)核的敏感度、特異度、陽性預測值及陰性預測值。 結(jié)果 共有234例涂陰疑似肺結(jié)核患者進入最后分析，其中58例培養(yǎng)陽性，112例為培養(yǎng)陰性經(jīng)過臨床診斷的肺結(jié)核患者，64例為非肺結(jié)核患者。以培養(yǎng)法為計算陽性標準，SAT-TB檢測BALF診斷涂陰肺結(jié)核的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為81.0%(47/58，95%CI：69.0%～90.1%)、96.9%(62/64，95%CI：88.9%～100.0%)、95.9%(47/49，95%CI：86.4%～100.0%)及84.9%(62/73，95%CI：75.3%～92.2%)。SAT-TB的檢測時間約2 h，快于培養(yǎng)法的31 d。結(jié)論 SAT-TB可通過檢測BALF為涂陰肺結(jié)核患者提供快速、可靠的診斷依據(jù)，是一項有價值的診斷方法。

結(jié)核, 肺/診斷； 支氣管肺泡灌洗液； 核酸擴增技術(shù)

結(jié)核病是危害人類健康的重大傳染病之一，據(jù)最新全球結(jié)核病報告數(shù)據(jù)，2012年全球有860萬例結(jié)核病新發(fā)及130萬例死亡患者，死亡率在傳染病中位居全球第二[1]。結(jié)核病的發(fā)現(xiàn)率在結(jié)核病控制中起著關(guān)鍵的作用。痰涂片及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)仍然是確診肺結(jié)核的傳統(tǒng)方法，但痰涂片陽性率在我國總體不高，僅為10%～30%[2]，而培養(yǎng)法卻需要6～8周。因此，臨床上痰涂片陰性甚至無痰的肺結(jié)核疑似患者占到肺結(jié)核所有患者的絕大多數(shù)，傳統(tǒng)方法因為陽性率低及耗時較長，已經(jīng)不能滿足臨床對肺結(jié)核快速診斷的需求。近年來，多種結(jié)核分枝桿菌的快速診斷方法均已建立，主要是以DNA或者RNA作為檢測靶標的分子生物學技術(shù)、噬菌體快速診斷法、基因芯片法等[3-5]。但是真正有效用于臨床的只有Bactec MGIT 960快速培養(yǎng)法及以DNA擴增為基礎(chǔ)的熒光探針定量PCR技術(shù)。前者可作為確診的“金”標準，卻仍然需要2～4周培養(yǎng)時間。對于后者，筆者曾經(jīng)的臨床研究發(fā)現(xiàn)痰熒光定量PCR法陽性率與痰涂片比較無明顯的優(yōu)越性，且有污染出現(xiàn)假陽性的可能，并不能取代痰涂片的傳統(tǒng)地位[6]。

結(jié)核分枝桿菌RNA恒溫擴增實時檢測技術(shù)(SAT-TB)是以結(jié)核分枝桿菌特異的16s rRNA為靶標，通過恒溫RNA擴增技術(shù)，熒光標記的探針與靶標片段的擴增產(chǎn)物雜交后釋放出熒光信號，對熒光信號進行實時檢測，從而快速準確地判斷待檢樣本中是否有結(jié)核分枝桿菌存在。筆者已有的研究發(fā)現(xiàn)SAT-TB對臨床確診的肺結(jié)核患者痰標本檢出率為54%，高于羅氏培養(yǎng)法(42%)，而且整個操作只需要1.5～2 h，未發(fā)現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，對于痰涂片陽性的標本，SAT-TB對肺結(jié)核的診斷敏感度可達97.6%[7-8]。但SAT-TB對于痰涂片陰性的疑似肺結(jié)核患者的快速診斷價值究竟如何尚缺少認識，且近年已經(jīng)發(fā)表的SAT-TB臨床研究檢測標本集中在痰液[9-10]，對于檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)尚缺乏較大樣本的數(shù)據(jù)支持。本研究將涂陰疑似肺結(jié)核患者收集BALF，進行SAT-TB的檢測，評價SAT-TB通過檢測BALF對涂陰肺結(jié)核的快速診斷價值。

對象和方法

一、研究對象

選取2012年6月至2014年6月期間收治入同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核科的疑似肺結(jié)核患者252例。必須滿足以下條件者作為研究對象：(1)發(fā)現(xiàn)肺部異常陰影，疑似肺結(jié)核患者；(2)痰涂片熒光抗酸染色連續(xù)3次陰性者；無痰患者行咽試子涂片3次陰性者；(3)取得患者知情同意，且知情簽字同意行電子支氣管鏡檢查者。入院后肺結(jié)核疑似患者痰涂片陽性者排除此項研究。臨床試驗注冊號：0000-0002-9411-496X。

二、方法

1. 肺結(jié)核診斷標準：根據(jù)文獻[11]和[12]。將涂陰疑似結(jié)核病患者分為3類：(1)確診肺結(jié)核：指影像學具有疑似肺結(jié)核表現(xiàn)的患者具有呼吸道標本結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性(簡稱“培陽”)；或者具有肺部病變標本病理學診斷證據(jù)；(2)臨床診斷肺結(jié)核：不具備細菌學及病理學診斷證據(jù)，痰菌培養(yǎng)陰性(簡稱“培陰”)，但胸部影像學顯示與活動性肺結(jié)核相符的病變，具有咳嗽、咯痰、咯血等癥狀，經(jīng)過診斷性抗結(jié)核治療隨訪病灶好轉(zhuǎn)或能夠排除其他肺部疾病者；(3)非肺結(jié)核患者：指診斷為肺結(jié)核以外的其他肺部疾病，且經(jīng)過非結(jié)核病治療好轉(zhuǎn)者。

2. 臨床檢測方法：患者檢測痰涂片、痰Bactec MGIT 960培養(yǎng)以及其他鑒別診斷需要的相關(guān)檢測，所有研究對象行支氣管鏡檢查，行支氣管鏡刷檢涂片抗酸染色及支氣管肺泡灌洗，收集BALF 5～10 ml。

3. BALF的SAT-TB法：BALF進行SAT-TB檢測，使用SAT-TB試劑盒(上海仁度生物科技有限公司)進行操作，與痰液的標本前處理略有不同，BALF視清濁度不同，對于帶有黏液的BALF標本可適量加入一些4%NaOH溶液進行液化，最多不超過樣本量的1倍體積。同時行BALF的Bactec MGIT 960檢測作為參照。

4. 同期收集患者臨床資料：姓名、年齡、性別、診斷結(jié)果、胸部CT、血結(jié)核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)、血結(jié)核抗體、抗炎前后影像學資料的對照等結(jié)果，隨訪所有入選患者的治療過程，隨訪至少6個月。

5. SAT-TB與臨床現(xiàn)有診斷方法進行比較：比較BALF SAT-TB檢測與支氣管鏡刷檢涂片抗酸染色、BALF Bactec MGIT 960對涂陰肺結(jié)核的診斷價值。

6. 統(tǒng)計學分析：根據(jù)SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行分析，以BALF的Bactec MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果作為陽性標準結(jié)果，計算診斷的敏感度、特異度、陽性預測值(PPV)、陰性預測值(NPV)、陽性似然比(LR+)、陰性似然比(LR-)，兩組之間“率”的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、臨床資料

共有疑似肺結(jié)核患者252例進入研究，其中17例入院后檢查痰濃縮熒光抗酸染色陽性而退出該研究，入組檢測患者235例，男155例，女80例。在隨訪中發(fā)現(xiàn)1例男性患者最終因診斷不明退出分析。進入最后分析的患者例數(shù)234例，其中肺結(jié)核患者170例，年齡(36.6±14.8)歲，非肺結(jié)核患者64例，年齡(45.2±16.4)歲。非肺結(jié)核的患者中肺炎37例(57.8%)，肺癌7例(10.9%)，支氣管擴張5例(7.8%)，陳舊性結(jié)核伴細菌感染6例(9.4%)，肺部真菌感染4例(6.3%)，非結(jié)核分枝桿菌肺病2例(3.1%)，塵肺3例(4.7%)。診斷為肺結(jié)核的170例患者中，合并結(jié)核性胸膜炎5例，合并糖尿病8例，合并頸部淋巴結(jié)結(jié)核5例。經(jīng)過支氣管鏡活檢病理確診者3例，具有病理確診者的患者快速培養(yǎng)結(jié)果均為陽性。支氣管鏡刷檢熒光抗酸染色陽性者2例，所有刷檢涂片陽性的患者均得到培陽的結(jié)果。

最后經(jīng)過BALF Bactec MGIT 960培養(yǎng)及結(jié)核科門診隨訪，得到培陽的確診肺結(jié)核患者58例，培陰、缺乏病理依據(jù)，但經(jīng)過診斷性抗結(jié)核治療門診隨訪臨床診斷為肺結(jié)核者112例，非肺結(jié)核患者64例。

二、以培養(yǎng)法為標準，BALF的SAT-TB診斷涂陰肺結(jié)核的價值

在確診肺結(jié)核組中，SAT-TB陽性者47例，SAT-TB陰性者11例，而非肺結(jié)核組中，SAT-TB出現(xiàn)2例陽性，提示假陽性(表1)。以培養(yǎng)法陽性結(jié)果作為判斷肺結(jié)核標準，非肺結(jié)核作為陰性標準，SAT-TB檢測BALF診斷涂陰肺結(jié)核的敏感度為81.0%(95%CI：69.0%～90.1%)、特異度96.9%(95%CI：88.9%～100.0%)、陽性預測值95.9%(95%CI：86.4%～100.0%)、陰性預測值84.9%(95%CI：75.3%～92.2%)(表1，2)；SAT-TB對培陰肺結(jié)核的診斷效率見表2。

三、以臨床診斷為標準，SAT-TB檢測BALF診斷涂陰肺結(jié)核的價值

若以臨床診斷作為判斷肺結(jié)核的陽性標準，臨床診斷肺結(jié)核包括培陽及培陰肺結(jié)核，非肺結(jié)核患者例數(shù)為陰性標準，SAT-TB診斷涂陰肺結(jié)核的敏感度40.0%(68/170，95%CI：33.0%～48.0%)、特異度96.9%(62/64，95%CI：89.0%～100.0%)、陽性預測值97.1%(68/70，95%CI：90.0%～100.0%)、陰性預測值37.8%(62/164，95%CI：30.0%～46.0%)。培養(yǎng)法在所有肺結(jié)核患者中的陽性率為34.1%(58/170)，SAT-TB的陽性率(40.0%，68/170)略高于培養(yǎng)法。有2例假陽性，考慮為污染的可能。

表1 SAT-TB檢測BALF對涂陰肺結(jié)核的診斷結(jié)果

表2 SAT-TB檢測BALF對培陽及培陰肺結(jié)核的診斷價值

注 “-”表示無意義；敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))；陽性預測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))；陰性預測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))

四、SAT-TB檢測時間與培養(yǎng)法、支氣管鏡下活檢、涂片法比較

在檢測時間上，SAT-TB檢測BALF的時間從操作氣管鏡取標本到實驗室操作完成平均時間為0.5 d，Bactec MGIT 960培養(yǎng)法平均為(31±4.6) d，氣管鏡下活檢病理檢測時間為3 d，氣管鏡刷檢檢測時間為1 d，SAT-TB檢測時間較培養(yǎng)法明顯縮短，SAT-TB與快培法的診斷一致率較高，kappa值為0.80(表3)。

討 論

一、SAT-TB的工作原理及檢測優(yōu)勢

SAT-TB檢測的靶標為結(jié)核分枝桿菌的16s rRNA，此檢測技術(shù)的優(yōu)點在于恒溫42 ℃擴增、起始靶標及擴增產(chǎn)物都是RNA，RNA定量檢測可直接反映檢測標本活菌的存在與否。RNA在環(huán)境中容易降解，因此污染更少、擴增效率高(30 min內(nèi)擴增10億倍)、反應穩(wěn)定。與痰涂片抗酸染色相比較，操作時間從1 d縮短到1.5～2 h；直接適時擴增標本中的RNA，可反映活菌的數(shù)量，而痰涂片無法鑒定細菌的死活，而SAT-TB對標本中含有非結(jié)核分枝桿菌者檢測結(jié)果為陰性，優(yōu)于涂片法，后者無法鑒別結(jié)核分枝桿菌及非結(jié)核分枝桿菌。

表3 以臨床診斷肺結(jié)核為標準對不同臨床方法的診斷價值進行比較

注a：在170例肺結(jié)核患者中2例刷檢陽性；b：在170例肺結(jié)核患者中3例活檢陽性；敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))

二、BALF SAT-TB對涂陰肺結(jié)核的診斷效率評估

從該研究結(jié)果可看出，若以培陽作為計算肺結(jié)核的金標準，非肺結(jié)核為陰性標準，SAT-TB診斷涂陰肺結(jié)核的敏感度為81.0%，特異度為96.9%。將該技術(shù)與目前最新使用的其他分子生物學診斷方法進行比較，Xpert Mtb/RIF為最被認可的新型分子生物學診斷技術(shù)，該技術(shù)以待測標本的結(jié)核分枝桿菌 DNA的靶基因(rpoB)為檢測目標，使用全自動PCR一體化檢測方法，被WHO推薦使用，近期發(fā)表的研究報道Xpert Mtb/RIF診斷涂陰肺結(jié)核的敏感度為61%～81%不等[13-14]，Theron等[15]同樣用BALF的Xpert Mtb/RIF診斷涂陰及無痰肺結(jié)核的敏感度為93%，特異度為96%，Le Palud等[16]用Xpert Mtb/RIF檢測BALF對培陽標本的診斷敏感度為80%，特異度為98.6%；其他方法如Kim等[14]研究巢式PCR法診斷結(jié)核病的敏感度僅為69.4%，以IS6110為基礎(chǔ)的環(huán)介導恒溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[17]檢測呼吸道標本診斷肺結(jié)核的敏感度可達89.6%，同一研究中的巢式PCR法和家庭式普通PCR法的診斷敏感度僅分別為79.2%和59.7%，特異度為100.0%。因此，與其他最新使用的分子生物學診斷技術(shù)比較，筆者用SAT-TB檢測BALF診斷涂陰肺結(jié)核的敏感度與最新使用的其他分子生物學技術(shù)Xpert Mtb/RIF和LAMP相似，比經(jīng)典的PCR法敏感度高。因此，SAT-TB檢測BALF能提供較高的診斷敏感度及特異度。但是，從數(shù)據(jù)中不難發(fā)現(xiàn)，58例培陽標本中有11例SAT-TB陰性，說明產(chǎn)生了假陰性結(jié)果，與培養(yǎng)法比較SAT-TB的檢出率為81.0%，而非100.0%，而21例培陰的肺結(jié)核患者標本中卻被SAT-TB檢出陽性。因此，若以臨床診斷肺結(jié)核為計算肺結(jié)核陽性標準，SAT-TB對肺結(jié)核的檢出率略高于培養(yǎng)法，但臨床仍有約20%的培陽患者通過SAT-TB法無法檢出。

此外，從檢測時間上比較，SAT-TB的檢測速度明顯快于快培法，而檢測結(jié)果與培養(yǎng)法的一致率達0.80，也就是說SAT-TB能夠在最短的時間內(nèi)提供準確率為80%的診斷結(jié)果； SAT-TB的檢出率(40.0%)略高于培養(yǎng)法(34.1%)，因此，SAT-TB為一項快速、有價值的診斷工具。今后可擴大標本的檢測范圍到胸腔積液、腹腔積液、腦脊液、淋巴結(jié)穿刺膿液等探索SAT-TB對肺外結(jié)核的診斷價值。

三、SAT-TB檢測的缺點及可能產(chǎn)生的原因分析

分析不同的呼吸道標本檢測，與筆者前期研究結(jié)果[18]比較，發(fā)現(xiàn)SAT-TB檢測BALF對結(jié)核分枝桿菌的檢出率低于痰液標本，筆者前期研究將SAT-TB檢測涂陰肺結(jié)核的痰液標本的診斷敏感度和特異度分別為93%和98%，而理論上認為BALF的標本檢出率應該高于痰液標本。究其原因，發(fā)現(xiàn)如下因素可能影響該項研究SAT-TB的檢測效率：(1)標本取出后放置的時間過長。BALF的標本首先需要通過支氣管鏡，標本得到后對標本進行分裝，部分標本需要送臨床常規(guī)檢測，筆者在課題實施過程中將BALF取出、分裝等室溫下經(jīng)歷的時間長達4 h以上，部分標本還經(jīng)過冰箱冷凍集中送檢，與痰液相比，室溫放置的時間過長可能導致SAT-TB對標本中16s rRNA的檢出率降低；(2)臨床操作氣管鏡時對支氣管沖洗的部位不夠精確、BALF的量偏少，這些因素都可能導致對結(jié)核分枝桿菌的檢出率降低；(3)盡管SAT-TB操作技術(shù)污染率低，筆者仍然發(fā)現(xiàn)了2例假陽性結(jié)果，因此分析在取BALF時容易通過內(nèi)鏡消毒不嚴、標本運送等操作環(huán)節(jié)造成標本污染；(4)此外，除了標本運送方面的原因，檢測人員的操作環(huán)節(jié)仍有探索的空間，可能存在標本的前處理因素的干擾，因此BALF的標本處理方法可能需要改良。在該項技術(shù)的今后臨床使用中，以上是值得關(guān)注的重要因素，若處理不當，則可能限制該技術(shù)在臨床上的廣泛應用，降低其實際診斷價值。

四、小結(jié)

SAT-TB檢測BALF在涂陰培陽肺結(jié)核中的診斷敏感度達81.0%、特異度96.9%，檢測時間僅2 h，在肺結(jié)核患者的BALF標本中SAT-TB對結(jié)核分枝桿菌的檢出率(40.0%)略高于培養(yǎng)法(34.1%)，SAT-TB檢測BALF是一項對涂陰肺結(jié)核患者快速、有價值的診斷方法之一。

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(本文編輯：郭萌)

Fast diagnostic value of SAT-TB for smear-negative pulmonary tuberuclosis using bronchoalveolar lavage fluid

FAN Lin, WANG Peng, YANG Yan, MA Jun, GE Yan-ping, WEI Wei, CUI Zhen-ling.

Clinic and Research Center of Tuberculosis, Shanghai Key of Tuberculosis, Shanghai Pulmonary Hospital, Tongji University School of Medicine, Shanghai 200433, China

FAN Lin, Email: fanlinsj@163.com

Objective To study the diagnostic value of SAT-TB(simultaneous amplification and testing forMycobacteriumtuberculosis) for smear-negative pulmonary tuberculosis(PTB) by testing bronchoalveolar lavage fluid (BLAF). Methods From June 2012 to June 2014 in Shanghai Pulmonary Hospital Tongji University, we screened 252 suspected PTB patients with 3 consecutive negative sputum smears, and obtained their BLAF specimen by brochchoscopy. BALF was tested by both Bactec MGIT 960 culture and SAT-TB assay. We diagnosed all patients, followed up for at least 6 months and collected associated information of patients regarding final diagnosis, culture results, imaging changes. The sensitivity, specificity, PPV and NPV for each diagnostic test were calculated using culture results as reference standard. Results Of 234 PTB suspects included in the final analysis, 58 were TB culture positive, 112 were PTB patients by clinical diagnosis with culture negative, 64 were non-TB patients. Using culture confirmed results as reference standard, the sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value of SAT-TB for smear-negative PTB testing BALF were 81.0%(47/58, 95%CI：69.0%-90.1%), 96.9%(62/64，95%CI：88.9%-100.0%), 95.9% (47/49，95%CI：86.4%-100.0%) and 84.9%(62/73, 95%CI：75.3%-92.2%). The detection time of SAT-TB was around two hours, remarkably shorter than 31 days needed by culture. Conclusion SAT-TB can provide reliable, fast diagnostic evidence for smear- negative PTB and is a valuable diagnostic method.

Tuberculosis, pulmonary/diagnosis； Bronchoalveolar lavage fluid； Nucleic acid amplification sechniques

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.02.005

上海市衛(wèi)生局科研課題計劃任務(20124183)

200433 同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核病臨床診療中心 上海市結(jié)核病(肺)重點實驗室

范琳，Email: fanlinsj@163.com

2014-10-18)