林燕真 程通 張雅麗 李瑞銀 楊連威 溫蘭玲

卵巢癌死亡率居婦科惡性腫瘤之首，患者對化學治療藥物的耐藥及多藥耐藥（MDR）是造成總體預后不良的主要原因之一，如何逆轉(zhuǎn)MDR已成為目前腫瘤化療研究的熱點。研究顯示，mdr1基因及其表達產(chǎn)物P-gp蛋白是引起腫瘤細胞產(chǎn)生MDR現(xiàn)象的主要原因[1-2]。故應用RNAi技術抑制腫瘤細胞中mdr1基因的表達，下調(diào)P-gp蛋白表達水平是逆轉(zhuǎn)MDR的一種重要方法。目前已有研究顯示，靶向mdr1基因的siRNA可用于下調(diào)卵巢癌細胞的P-gp蛋白表達水平[3]。而在RNAi技術應用中，除了需要獲得具有高效抑制能力的RNAi元件，如何實現(xiàn)RNAi元件在特定組織細胞中的高效特異表達也是十分重要的。P-gp蛋白也存在于人正常組織中，故使RNAi元件的表達僅限于目標腫瘤細胞顯得尤為重要。但目前siRNA表達中常規(guī)使用的啟動子如H1、U6等均缺乏組織特異性，不能滿足要求。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）啟動子是一種腫瘤細胞特異性啟動子，在大多數(shù)正常組織中不具表達活性，已被報道可用于在肺癌、肝癌、卵巢癌等腫瘤細胞中特異表達外源基因[4]。目前，應用hTERT啟動子介導RNAi元件用于卵巢癌細胞的MDR逆轉(zhuǎn)研究尚未見報道。本研究即提出了以腫瘤組織特異性hTERT啟動子介導靶向mdr1基因的siRNA在卵巢癌細胞中的特異表達，以達到特異性抑制mdr1表達并逆轉(zhuǎn)卵巢癌MDR的目的。本研究結果可為進一步開展逆轉(zhuǎn)卵巢癌MDR研究提供重要基礎，現(xiàn)將本研究報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 限制性核酸內(nèi)切酶、磷酸化酶分別購自大連寶生物工程有限公司、New England Biolabs公司或華美生物工程公司，T4 DNA連接酶購自北京天根公司，Taq酶購自上海生工公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒為上海華舜公司產(chǎn)品，DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM、Glutamine、細胞培養(yǎng)用非必需氨基酸購自Invitrogen公司，酵母粉購自OXOID公司，配液用水由Millipore公司純水儀過濾，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司，細胞培養(yǎng)用胎牛血清（FBS）購自Gibico公司。Dual-Luciferase?雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)購自Promega公司，抗體Phycoerythrin（PE） Anti-Human MDR1購自BD Pharmingen?公司，SYBR PrimeScriptTM RT-PCR kit購 自 TaKaRa公 司，Cell Counting Kit-8試劑購自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 phTERT-siMDR1B表達載體的構建 在前期研究中已篩選獲得1個可高效靶向mdr1基因的siRNA元件siMDR1B[5]。其靶序列為：5’-AGAAAGAACTTGAAAGGTA-3’（位于 mdr1基因序列的1230~1248 nt）。以靶向HBV基因的B245作為對照[6]。合成各siRNA靶點序列所對應的siRNA引物（表1），引物兩端分別引入Hind Ⅲ與Bgl Ⅱ酶切位點，經(jīng)退火處理后與Bgl Ⅱ/Hind Ⅲ雙酶切處理的pBT-del-279載體連接，經(jīng)酶切及測序鑒定后獲得攜帶hTERT啟動子引導的siMDR1B表達元件的表達載體phTERT-siMDR1B及對照質(zhì)粒phTERT-B245。

表1 siRNA合成的引物序列

1.2.2 報告質(zhì)粒的構建 合成PCR引物（表2）擴增mdr1基因上不包含和包含siMDR1B靶點所在位置的約250 bp長度的DNA序列（MT1和MT2），其中siMDR1B靶點序列位于MT2序列中。PCR產(chǎn)物分別與pMD18-T載體連接，經(jīng)酶切及測序鑒定獲得含單倍體靶序列的質(zhì)粒pT-T。pT-T經(jīng)BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ雙酶切后回收目的片段，再與經(jīng)Bgl Ⅱ/EcoR Ⅰ雙酶切處理的pT-T載體連接獲得含雙倍體靶序列的pT-TT。pT-TT經(jīng)BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ雙酶切后回收雙倍體靶序列片段，與經(jīng)同樣雙酶切處理的pST-luc載體連接，經(jīng)酶切鑒定得到分別含不同區(qū)段雙倍體靶序列的報告質(zhì)粒pSTluc-MT1和pSTluc-MT2。

表2 報告質(zhì)粒PCR擴增引物序列

1.2.3 熒光素酶活性檢測 在24孔培養(yǎng)板中每孔鋪入2×105個細胞，12 h后換液，將攜帶待檢測啟動子-luc報告基因表達元件的質(zhì)粒用脂質(zhì)體對細胞進行轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒用量為0.6 μg。轉(zhuǎn)染后48 h裂解細胞，檢測細胞裂解液中的熒光素酶活性。檢測試劑為Promega公司產(chǎn)品Dual-Luciferase?雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，檢測過程參照說明書進行。

1.2.4 流式細胞術檢測轉(zhuǎn)染后細胞中P-gp蛋白的表達 轉(zhuǎn)染48 h后消化細胞制成細胞懸液，收集約1×106個細胞，1000 r/min離心3 min，預冷的PBS洗1次。用1 mL含5%血清的PBS重新懸浮細胞，4 ℃孵育10 min，1000 r/min離心3 min去上清。加入含5%Phycoerythrin（PE） anti-human MDR1 的 PBS 100 μL，4 ℃避光孵育60 min，離心棄上清。用PBS洗滌2次，加入1 mL PBS重懸細胞。使用EPICS XL流式細胞儀進行檢測，數(shù)據(jù)應用CellQuest軟件進行分析。

1.2.5 RT-PCR方法檢測細胞中mdr1基因的mRNA水平 細胞經(jīng)消化后，用Trizol試劑提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板進行PCR檢測，以細胞看家基因GADPH為對照。mdr1的PCR擴增引物序列為：mdr1f：5’-ATGTAAGGTTTCTACGGGA-3’；mdr1r：5’-ATCCACGGACACTCCTACG-3’。PCR 反應條件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 50 s，54 ℃ 50 s，72 ℃50 s，30 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。取 3 μL PCR.產(chǎn)物行1.5 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外照相并進行掃描分析，重復檢測3次。

1.2.6 CCK8 kit檢測轉(zhuǎn)染后細胞紫杉醇藥物半數(shù)致死量（IC50）[7]預先在24孔板上進行共轉(zhuǎn)染實驗（具體方法同前），36 h后將24孔板上的細胞消化并重新鋪到96孔板，細胞數(shù)量為5000個/孔。12 h后分別加入不同濃度的紫杉醇（分別為32 000、8000、2000、500、125、32、8、2、0 ng/mL）， 孵育24 h后再加入10 μL CCK8溶液，37 ℃ 5% CO2孵育3 h，檢測OD450/OD620值。根據(jù)寇氏改良公式：抑制率=（未處理細胞的OD值-處理后細胞的OD值）/未處理細胞的OD值[7]。計算不同濃度的紫杉醇的抑制率，并利用IC50計算軟件計算出藥物的IC50。

2 結果

2.1 hTERT啟動子在卵巢癌細胞的表達活性 hTERT啟動子在卵巢癌細胞A2780可有效啟動luc報告基因的表達，而在人二倍體細胞MRC-5中沒有顯示出表達活性，見圖1。

圖1 不同細胞hTERT啟動子轉(zhuǎn)錄活性比較

2.2 hTERT啟動子介導的靶向mdr1的siRNA的表達載體構建 本研究構建的hTERT啟動子介導的siMDR1B可獲得良好的抑制效果，可有效抑制pSTluc-MT2的表達，體現(xiàn)出良好的抑制特異性，見圖2。

圖2 hTERT啟動子引導的靶向mdr1的siRNA的抑制效率

2.3 hTERT啟動子介導的siMDR1B對mdr1基因轉(zhuǎn)錄與表達的抑制效果 phTERT-siMDR1B轉(zhuǎn)染細胞的mdr1的mRNA水平低于對照組細胞，說明了hTERT啟動子介導的siMDR1B表達可有效抑制靶基因mdr1的mRNA水平；與轉(zhuǎn)染對照組細胞相比，轉(zhuǎn)染phTERT-siMDR1B細胞中的P-gp蛋白活性明顯降低，與轉(zhuǎn)染對照組細胞比對P-gp蛋白的抑制效率為65.5%，hTERT啟動子介導的siMDR1B對mdr1基因表達具有較好的抑制效果。見圖3。

圖3 siMDR1B在轉(zhuǎn)染后細胞中對mdr1基因mRNA水平及蛋白水平的抑制效果

2.4 hTERT啟動子介導的siMDR1B逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞MDR 與對照組相比轉(zhuǎn)染了hTERT啟動子介導的siMDR1B表達元件的細胞對紫杉醇的耐藥程度顯著降低，hTERT啟動子介導的siMDR1B能夠用于卵巢癌細胞的MDR逆轉(zhuǎn)。見圖4。

圖4 hTERT啟動子介導的siMDR1B對紫杉醇的耐藥程度

3 討論

紫杉醇是卵巢腫瘤化療常用藥之一，腫瘤細胞對包括紫杉醇在內(nèi)的治療藥物產(chǎn)生多藥耐藥（MDR）是導致對腫瘤化療失敗的重要原因。研究顯示，腫瘤細胞中mdr1基因編碼的P-gp蛋白過表達與MDR產(chǎn)生密切相關[8]。通過抑制腫瘤細胞中mdr1基因的表達可實現(xiàn)腫瘤細胞的耐藥逆轉(zhuǎn)[9]。RNAi技術可用于特異、高效地抑制細胞內(nèi)靶基因的表達，在抑制mdr1基因以及MDR逆轉(zhuǎn)研究中具有良好的應用潛力。已有研究顯示，靶向mdr1基因的siRNA可抑制骨肉瘤、腎癌、肺癌、肝癌、卵巢癌細胞中的mdr1表達并逆轉(zhuǎn)耐藥[10-12]。然而在RNAi抗腫瘤研究中，實現(xiàn)siRNA對腫瘤組織細胞的特異性導入或表達是十分重要的，特別是以在一些正常組織細胞中也有表達的mdr1基因作為抑制靶標時。本研究構建了腫瘤細胞特異性啟動子hTERT引導的靶向mdr1基因的siRNA表達元件，并證明其可在卵巢癌細胞中特異表達并有效抑制mdr1基因，并可逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞對紫杉醇藥物的耐藥，為進一步應用RNAi技術開展卵巢癌MDR逆轉(zhuǎn)研究提供了重要基礎。

人類卵巢組織較為復雜，也是全身各臟器中腫瘤類型最多的部位，卵巢腫瘤細胞也缺乏特異的標志物，因此研究可針對相關腫瘤細胞的靶向技術對于發(fā)展更為高效的卵巢腫瘤治療方法是十分重要的。靶向轉(zhuǎn)錄是一種有效的可實現(xiàn)治療分子如siRNA在目標細胞中表達的重要策略[13]。靶向轉(zhuǎn)錄技術是利用組織和細胞特異性啟動子控制基因的轉(zhuǎn)錄，從而使治療基因元件如siRNA表達元件可在特定的細胞中表達以達到靶向治療的目的。目前尚未發(fā)現(xiàn)可特異靶向卵巢腫瘤細胞的啟動子。hTERT是端粒酶的限速酶，對端粒酶的活性調(diào)控起重要作用。hTERT啟動子已被發(fā)現(xiàn)是一種腫瘤細胞特異性啟動子，可在包括肺癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞中均具有表達活性[14]。本研究結果顯示，hTERT啟動子在卵巢腫瘤細胞中也具有良好的轉(zhuǎn)錄活性，具有較好的腫瘤細胞特異性和有效性。

包括hTERT啟動子在內(nèi)目前已鑒定獲得多個具有腫瘤細胞特異性的啟動子，其中部分已應用于腫瘤治療方法研究。根據(jù)其對腫瘤細胞的轉(zhuǎn)錄活性可分為3類，第1類為可靶向多數(shù)腫瘤細胞的啟動子，如hTERT啟動子、P53啟動子、survivin啟動子等；第2類為靶向特定腫瘤細胞的啟動子，如肝癌細胞特異的AFP啟動子、結腸癌特異的CEA啟動子等；第3類為可特異靶向特定組織細胞的啟動子，如前列腺細胞特異性抗原啟動子（PSA啟動子）等。這些啟動子均為RNA聚合酶Ⅱ類啟動子。在siRNA表達中通常使用的是RNA聚合酶Ⅲ類啟動子，如U6、H1啟動子，這些啟動子在引導siRNA表達中具有較強的轉(zhuǎn)錄活性，然而往往容易造成表達過量而影響細胞正常功能，相對而言RNA聚合酶Ⅱ類啟動子具有較廣的選擇范圍，包括許多組織特異性或誘導型啟動子，從而有利于對siRNA脫靶效應的控制[15]。然而，RNA聚合酶Ⅱ類啟動子是否可應用于siRNA的有效表達尚未獲得充分的確定。目前已有研究顯示，一些組織特異性啟動子如T7啟動子可用于介導siRNA在特定組織中的表達和抑制作用[6]。本研究結果證明，hTERT啟動子作為RNA聚合酶Ⅱ類啟動子可以介導靶向mdr1基因的siRNA在卵巢腫瘤細胞中的特異表達，并逆轉(zhuǎn)卵巢腫瘤細胞MDR。由于hTERT啟動子在包括肺癌、肝癌、卵巢癌等其他多種腫瘤細胞中均具有表達活性，該基因治療策略配合化療藥物有望能夠擴大治療的覆蓋范圍，有利于更大限度地抑制腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤的生長，具備較好的應用潛力。在導入方法改進上，hTERT啟動子介導的siRNA表達元件可克隆入溶瘤病毒中，以實現(xiàn)雙重靶向調(diào)控作用，并利用溶瘤病毒的自我擴增作用加強siRNA元件的表達，以達到更好的抑制腫瘤的效果。本研究結果可為進一步開展卵巢腫瘤MDR逆轉(zhuǎn)和治療方法研究提供基礎。

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