韓江全，盧俊江，向燦輝，劉承靈，王正遠(yuǎn)，劉玲，陳玲，范婭丹

(遵義醫(yī)學(xué)院1第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，2珠海校區(qū)實(shí)驗(yàn)中心，廣東 珠海 519100;3南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院特需醫(yī)療中心，廣東 廣州 510000)

MicroRNA-155對(duì)糖尿病大鼠腦缺血損傷血管再生的調(diào)控*

韓江全1△，盧俊江1，3，向燦輝2，劉承靈1，王正遠(yuǎn)1，劉玲1，陳玲1，范婭丹1

(遵義醫(yī)學(xué)院1第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，2珠海校區(qū)實(shí)驗(yàn)中心，廣東 珠海 519100;3南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院特需醫(yī)療中心，廣東 廣州 510000)

目的:觀察microRNA－155(miRNA－155)表達(dá)對(duì)糖尿病大鼠腦缺血損傷及CD31、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的影響，探討miRNA－155對(duì)糖尿病加重腦缺血血管再生的調(diào)控作用。方法:SD大鼠腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型，繼而應(yīng)用栓線法建立永久性局灶性腦缺血模型。隨機(jī)分為5組:(1)假手術(shù)組(sham組);(2)腦缺血組(CI組);(3)糖尿病腦缺血組(DCI組);(4)糖尿病腦缺血+miRNA－155抑制物組(inhibitor組);(5)糖尿病腦缺血+陰性對(duì)照組(scramble組)。于缺血后24 h采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)miRNA－155的表達(dá)水平;參照Z(yǔ)ea－Longa 5分制行神經(jīng)功能缺損評(píng)分;2，3，5－氯化三苯基四氮唑(TTC)染色測(cè)梗死體積;Western blotting檢測(cè)血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子－1(PECAM－1/CD31)、VEGF的表達(dá)水平。結(jié)果:糖尿病腦缺血+miRNA－155抑制物組大鼠腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)的miRNA－155表達(dá)水平顯著低于糖尿病腦缺血組(P＜0.05)。miRNA－155表達(dá)下調(diào)可顯著減少糖尿病腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦梗死體積，但顯著增加CD31表達(dá)水平與VEGF表達(dá)水平(均P＜0.05)。結(jié)論:miRNA－155對(duì)糖尿病加重腦缺血損傷血管再生有重要的調(diào)控作用，miRNA－155表達(dá)下調(diào)可顯著減輕糖尿病大鼠腦缺血損傷。

微小RNA－155;糖尿病;腦缺血;血管再生

腦梗死是糖尿病的嚴(yán)重血管并發(fā)癥，糖尿病并發(fā)急性腦梗死占腦梗死的20%～25%，且梗死面積更大、癥狀更重，更容易形成進(jìn)展性卒中，預(yù)后更差［1－2］。糖尿病可加重腦缺血損傷的神經(jīng)元損害和血管損害已得到廣泛認(rèn)可，但其機(jī)制尚不完全清楚，仍未尋找出有效可行的治療措施。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類(lèi)小分子非編碼RNA，約由20～22個(gè)堿基組成。研究顯示，miRNAs可通過(guò)調(diào)控其靶mRNA翻譯過(guò)程發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控作用，從而廣泛參與細(xì)胞分化、增殖以及血管再生等多種生物現(xiàn)象［3］。miRNA－155是miRNAs家族中的一員，新近研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血損傷以及在多種腦損傷同時(shí)存在的情況下，miRNA－155表達(dá)呈現(xiàn)顯著變化［4－5］，提示miRNA－155在腦缺血損傷中發(fā)揮重要的調(diào)控作用;而抑制miRNA－155具有神經(jīng)保護(hù)作用，可能對(duì)腦缺血損傷的修復(fù)有益［5－6］。此外，血管再生(angiogenesis)已被證明可增加腦缺血后腦組織的血液灌注及改善神經(jīng)功能，在糖尿病加重腦缺血損傷中起著重要作用［2，7］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用人工合成miRNA－155抑制物下調(diào)糖尿病腦缺血大鼠腦內(nèi)的miRNA－155水平，探討miRNA－155對(duì)糖尿病大鼠腦缺血血管再生的影響。

材料和方法

1 材料

健康成年雄性SD大鼠購(gòu)自遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。RNA抽提試劑盒miRNeasy Mini購(gòu)自Qiagen;TaqMan?MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan?基因表達(dá)預(yù)混液以及TaqMan?MicroRNA Assays購(gòu)自Life Technologies;2，3，5－氯化三苯基四氮唑(TTC)試劑、鏈脲佐菌素購(gòu)自Sigma;TNF－α羊抗多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz;miR－155抑制物及陰性對(duì)照核苷酸購(gòu)自上海吉瑪生物公司。miR－155抑制物及其陰性對(duì)照核苷酸均溶解于滅菌生理鹽水中，濃度為0.2 g/L。

2 模型的制備

2.1 糖尿病動(dòng)物模型建立鏈脲佐菌素用0.1 mmol/L檸檬酸鈉－檸檬酸緩沖液(pH 4.2)在冰浴中配制成10 mg/L的濃度，于禁食8 h大鼠左下腹腹腔注射(55 mg/kg)。穩(wěn)定7 d后，用羅氏血糖儀測(cè)定大鼠尾尖血血糖，空腹血糖＞16.7 mmol/L的大鼠確定為糖尿病大鼠。

2.2 永久性局灶性腦缺血模型的建立采用Longa線栓法建立永久性大腦中動(dòng)脈阻塞腦缺血模型，均予阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈24 h。糖尿病大鼠于注射鏈脲佐菌素后6周建立腦缺血模型。

3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只，8～12周，體重240～280 g，均衡飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食。隨機(jī)分為6組:(1)假手術(shù)(sham)組:不阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈，假手術(shù)5 min經(jīng)側(cè)腦室注射等容量生理鹽水;(2)腦缺血(cerebral ischemia，CI)組:于腦缺血5 min時(shí)經(jīng)側(cè)腦室注射等容量生理鹽水;(3)糖尿病腦缺血(diabetes with cerebral ischemia，DCI)組:糖尿病大鼠于腦缺血5 min時(shí)經(jīng)側(cè)腦室注射等容量生理鹽水;(4)糖尿病腦缺血+miRNA－155抑制物(inhibitor)組:糖尿病大鼠于腦缺血5 min時(shí)經(jīng)側(cè)腦室注射miRNA－155抑制物10 μg;(5)糖尿病腦缺血+陰性對(duì)照(scramble)組:糖尿病大鼠于腦缺血5 min時(shí)經(jīng)側(cè)腦室注射miRNA－155陰性對(duì)照核苷酸10 μg。每組均10只大鼠。

4 主要方法

4.1 神經(jīng)功能評(píng)分參照Z(yǔ)ea－Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，于缺血24 h對(duì)各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分紀(jì)錄。2分或2分以上者視為造模成功。

4.2 梗死體積測(cè)定各組動(dòng)物于神經(jīng)功能缺損評(píng)分完畢后過(guò)量麻醉處死，迅速斷頭取腦，將鼠腦立即置于－20℃冰箱中20 min后取出，行2 mm厚連續(xù)冠狀切片，共5片。將切片立即置于2%氯化三苯四氮唑溶液中，37℃恒溫下避光染色30 min，然后置于4℃、4%多聚甲醛溶液中固定24 h。正常腦組織染為紅色，梗死組織為白色，數(shù)碼相機(jī)拍照，用Luxex－F圖像分析儀(日本富士)測(cè)定每張腦片的梗死面積，根據(jù)公式V=t(A1+A2+……An)－(A1+An) t/2計(jì)算梗死體積，其中t為切片厚度，A為梗死面積。

4.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real－time PCR)檢測(cè)miRNA－155的表達(dá)各組動(dòng)物于腦缺血24 h后，取大鼠腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)組織標(biāo)本。使用miRNeasy Mini試劑盒提取總RNA。根據(jù)TaqMan?MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明將RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄。將獲得cDNA稀釋10倍后使用TaqMan?MicroRNA Assays及TaqMan?基因表達(dá)預(yù)混液進(jìn)行real－time PCR反應(yīng)。采用U6為內(nèi)參照基因。通過(guò)2－ΔΔCt法統(tǒng)計(jì)各組間miRNA－155相對(duì)表達(dá)量。

4.4 Western blotting檢測(cè)CD31和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白的表達(dá)大鼠迅速斷頭取腦，冰上分離缺血側(cè)頂葉大腦皮質(zhì)約100 mg，冰上研磨組織后加預(yù)冷的蛋白裂解液，繼續(xù)碾磨至液態(tài)，然后4℃、12 000 r/min離心30 min，留上清液，取40 μL用BCA法進(jìn)行蛋白定量測(cè)定，所剩上清液按4∶1的比例加變性loading buffer，100℃水浴10 min。取蛋白樣品(40 μg)采用10%SDS－PAGE(Bio－Rad垂直板式電泳槽儀)120 min進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF。5%脫脂奶粉37℃封閉2 h，然后分別加入兔抗CD31和VEGF抗體(1∶500)，37℃孵育2 h，4℃過(guò)夜;偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)羊抗兔IgG(1∶2 000)室溫孵育2 h，LumiGLO發(fā)光，X－感光盒內(nèi)曝光。以上反應(yīng)均在塑料袋內(nèi)進(jìn)行，其間用PBS充分洗滌。為了檢測(cè)蛋白裂解/轉(zhuǎn)移的變化，所有的印跡均以麗春紅(抗體孵育前)和考馬斯亮藍(lán)(化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)后)染色。將膠片進(jìn)行掃描或拍照，采用HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，獲取各組Western blotting條帶的平均吸光度(A)值，內(nèi)參照為GAPDH，目的蛋白與GAPDH吸光度比值即為目的蛋白的相對(duì)值。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK－q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 各組造模前的血糖值

Sham組、CI組、DCI組、inhibitor組和scramble組造模前的血糖水平分別為(5.78±0.32)、(5.90± 0.27)、(16.96±1.65)、(16.93±1.15)和(16.97± 1.53)mmol/L，其中DCI組、inhibitor組及scramble組的血糖水平明顯高于CI組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而DCI組、inhibitor組與scramble組間無(wú)顯著差異。

2 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分

Sham組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分均為0分，其余各組大鼠在麻醉清醒后均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損。其中，與sham組比較，CI組、DCI組、inhibitor組和scramble組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分均明顯升高(P＜0.05);與CI組相比，DCI組和scramble組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分均明顯升高(P＜0.05)，但DCI組和scramble組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而inhibitor組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分較DCI組和scramble組均明顯降低(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積、miRNA-155、CD31及VEGF表達(dá)水平的比較Table 1.The neural deficit functional score，infarct size and the e? xpression of miRNA－155，CD31 and VEGF in the diabetic rats with different treatments(Mean±SD.n=5～10)

3 各組梗死體積的變化

Sham組未見(jiàn)有白色梗死區(qū)域，其余各組腦缺血側(cè)可見(jiàn)到明顯的白色梗死區(qū)。其中，與sham組比較，CI組、DCI組、inhibitor組和scramble組大鼠的梗死體積均明顯增大(P＜0.05);與CI組比較，DCI組和scramble組大鼠的梗死體積均明顯增大(P＜0.05)，但DCI組和scramble組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而inhibitor組大鼠的梗死體積較DCI組和scramble組明顯減小，見(jiàn)圖1、表1。

Figure 1.The TTC staining of the brain slices among 5 groups.The pale area represents the infarct region.圖1 各組大鼠腦組織TTC染色圖片

4 各組缺血周?chē)M織miRNA-155的表達(dá)

Sham組見(jiàn)少量miRNA－155表達(dá)，其余各組腦缺血側(cè)可見(jiàn)到明顯的miRNA－155表達(dá)。其中，與sham組比較，CI組、DCI組、inhibitor組和scramble組大鼠的miRNA－155表達(dá)均明顯增多(P＜0.05);與CI組比較，DCI組和scramble組大鼠的miRNA－155表達(dá)均增多明顯(P＜0.05)，但DCI組和scramble組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而inhibitor組大鼠的miRNA－155表達(dá)較DCI組和scramble組明顯減小(P＜0.05)，見(jiàn)圖2、表1。

Figure 2.The expression of miRNA－155 in cerebral cortex of the diabetic rats with different treatments determined by real－time PCR.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs CI;ΔP＜0.05 vs DCI.圖2 Real-time PCR檢測(cè)各組miRNA-155的表達(dá)

5 各組缺血周?chē)M織CD31、VEGF表達(dá)

Sham組見(jiàn)少量CD31、VEGF蛋白表達(dá)，其余各組腦缺血周?chē)M織可見(jiàn)到明顯的CD31、VEGF蛋白表達(dá)。其中，與sham組比較，CI組、DCI組、inhibitor組和scramble組大鼠的CD31、VEGF蛋白表達(dá)均明顯增多(P＜0.05);與CI組比較，DCI組和scramble組大鼠的CD31、VEGF蛋白表達(dá)均明顯減少(P＜0.05)，但DCI組和scramble組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而inhibitor組大鼠的CD31、VEGF蛋白表達(dá)較DCI組和scramble組明顯增多(P＜0.05)，見(jiàn)圖3、表1。

Figure 3.The protein expression of CD31 and VEGF in the cerebral cortex of ischemic penumbra determined by Western blotting.圖3 CD31和VEGF蛋白表達(dá)的Western blotting圖

討論

糖尿病是腦血管病發(fā)病和加重的重要危險(xiǎn)因素，它不僅能夠誘發(fā)腦缺血，而且能夠使腦缺血損傷進(jìn)一步加重。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與腦缺血組相比，糖尿病腦缺血大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分明顯增加，梗死體積顯著增大，與既往研究［1－2］一致，進(jìn)一步證實(shí)糖尿病加重腦缺血損傷，也提示糖尿病對(duì)缺血性腦損傷有加強(qiáng)效應(yīng)。糖尿病加重腦缺血損傷的病理機(jī)制迄今尚未完全清楚。近年研究證實(shí)，血管再生可增加腦缺血后腦組織的血液灌注及改善神經(jīng)功能，在糖尿病加重腦缺血損傷中起著重要作用［2，7］。血管再生為糖尿病加重腦缺血損傷的治療開(kāi)辟了一條再血管化的新途徑。目前在血管再生的研究中，微血管密度是普遍采用的較直觀能有效反映新生血管數(shù)目和側(cè)支循環(huán)建立情況的指標(biāo)。CD31又稱(chēng)為血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子－1(platelet endothelial cell adhesion molecule－1，PECAM－1)，主要由內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴結(jié)中分化期的單核細(xì)胞分泌，存在于血管內(nèi)皮和血小板中的一種糖蛋白，也是內(nèi)皮細(xì)胞的一種特異性標(biāo)記物。腦缺血梗死周?chē)鷧^(qū)微血管密度高，則CD31的蛋白表達(dá)明顯增加，故將CD31作為特異性標(biāo)記物，來(lái)反映組織中微血管密度已被廣泛采用［8］。而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是一種多功能細(xì)胞因子，具有促進(jìn)微動(dòng)脈、小動(dòng)脈血管通透性增加、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及誘導(dǎo)血管生成等作用;缺血后腦組織VEGF及受體表達(dá)增加，并與CD31表達(dá)呈正相關(guān)，對(duì)缺血腦組織具有保護(hù)作用，因此，VEGF已被作為反映血管再生的標(biāo)志性指標(biāo)［2］。研究顯示，局部腦缺血可引起VEGF表達(dá)上調(diào);單純升高血糖也會(huì)使VEGF表達(dá)增加，而糖尿病大鼠腦缺血模型的VEGF mRNA呈低水平表達(dá)［9］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究一致，提示缺血與高血糖聯(lián)合運(yùn)用對(duì)VEGF表達(dá)的影響未表現(xiàn)疊加效應(yīng)。究其原因，可能與缺血和高血糖時(shí)VEGF表達(dá)的調(diào)控途徑不同有關(guān)。目前認(rèn)為，低氧是引起VEGF表達(dá)上調(diào)的強(qiáng)效誘發(fā)因素，可通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子－1和(或)缺氧誘導(dǎo)蛋白來(lái)刺激VEGF的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。而高血糖引起VEGF表達(dá)上調(diào)的機(jī)制則與二酯酰甘油－蛋白激酶C途徑有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)顯示，糖尿病腦缺血大鼠的CD31和VEGF的表達(dá)較腦缺血組明顯減弱，而神經(jīng)功能評(píng)分明顯增加、梗死面積也顯著增大，進(jìn)一步證實(shí)糖尿病加重腦缺血損傷可能與VEGF低表達(dá)有關(guān)，另一方面也表明血管再生在糖尿病加重腦缺血再灌注損傷過(guò)程起著重要作用。miRNA是一類(lèi)進(jìn)化上保守的非編碼單鏈小RNA，能在轉(zhuǎn)錄后降解靶基因mRNA或抑制基因的翻譯。每一種miRNA可以通過(guò)調(diào)控多個(gè)靶mRNA表達(dá)。研究顯示miRNA幾乎參與了所有已知的生物學(xué)調(diào)控過(guò)程，顯示其強(qiáng)大的調(diào)控作用［3］。近年來(lái)，一些有關(guān)miRNA調(diào)控缺血誘導(dǎo)下血管再生研究已見(jiàn)報(bào)道［10］。但有關(guān)miRNA－155調(diào)控糖尿病加重腦缺血損傷血管再生的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。miRNA－155屬于microRNAs家族中的一員，位于非編碼基因Bic內(nèi)，在血液細(xì)胞中高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，永久性大腦中動(dòng)脈阻塞腦缺血損傷及在多種腦損傷同時(shí)存在的情況下，miRNA－155在腦內(nèi)海馬區(qū)表達(dá)改變顯著［4］。新近研究發(fā)現(xiàn)，miRNA－155在腦缺血皮質(zhì)區(qū)表達(dá)明顯上調(diào)［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病大鼠腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)miRNA－155表達(dá)較腦缺血組明顯上調(diào)，一方面表明miRNA－155表達(dá)具有廣泛性及作用機(jī)制的復(fù)雜性;另一方面提示miRNA－155可能參與了糖尿病加重腦缺血損傷的病理生理過(guò)程。為了進(jìn)一步明確miRNA－155在糖尿病加重腦缺血損傷的作用，我們使用miRNA－155抑制物進(jìn)行干預(yù)。miRNA抑制物是一類(lèi)經(jīng)人工合成或構(gòu)建的反義表達(dá)載體，通過(guò)堿基互補(bǔ)原理結(jié)合目的基因或mRNA上特定的序列(靶核酸)，從而最終達(dá)到基因控制和治療目的。由于miRNA抑制物基因治療具有高度特異性、經(jīng)濟(jì)方便及不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為當(dāng)前腫瘤治療研究熱點(diǎn)之一。在腦血管疾病方面，目前研究已發(fā)現(xiàn)［11］，抑制miR－145、－497、－181a、－1和－let－7f的表達(dá)對(duì)腦缺血損傷均具有神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miRNA－155抑制物可顯著減少腦缺血大鼠的miRNA－155表達(dá)水平，且可顯著改善糖尿病腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分，減少腦梗死體積，進(jìn)一步證實(shí)miRNA－155在糖尿病加重腦缺血損傷中起著重要的作用。其原因可能為:糖尿病加重腦缺血損傷過(guò)程與炎癥反應(yīng)及免疫密切相關(guān)［1－2］，而miRNA－155是一個(gè)多功能miRNA，參與了血細(xì)胞再生、炎癥和免疫等多種生物學(xué)過(guò)程，與腦缺血后炎性反應(yīng)密切相關(guān)［5］。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞在脂多糖刺激后，miRNA－155表達(dá)明顯上調(diào);敲除miRNA-155后，則細(xì)胞因子信號(hào)抑制蛋白－1顯著上調(diào)，一氧化氮產(chǎn)生以及炎癥細(xì)胞因子、誘導(dǎo)一氧化氮合酶表達(dá)明顯減少;原代培養(yǎng)神經(jīng)元在miRNA－155被抑制的條件培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，則減少神經(jīng)元死亡，因此，抑制miRNA－155表達(dá)具有神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)腦缺血損傷產(chǎn)生有益作用［4－5］。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA－155能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控血管緊張素Ⅱ1型受體，從而抑制血管緊張素Ⅱ的信號(hào)傳導(dǎo)［12］。由于血管緊張素Ⅱ與血管再生相關(guān)［13］，推測(cè)miRNA－155可能參與血管再生。另有研究發(fā)現(xiàn)［14］，miRNA－155在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞上呈現(xiàn)高表達(dá)，并能夠直接作用于血管緊張素II 1型受體上，降低血管緊張素II誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，抑制血管再生。新近研究發(fā)現(xiàn)，miRNA－155作為腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的調(diào)節(jié)因子，可直接抑制內(nèi)源性腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子產(chǎn)生，而后者對(duì)促進(jìn)血管再生有著重要的影響［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病腦缺血大鼠的miRNA－155表達(dá)明顯增強(qiáng)，則CD31和VEGF表達(dá)明顯減少，而抑制miRNA－155表達(dá)，則CD31和VEGF表達(dá)顯著增強(qiáng)，提示miRNA－155對(duì)糖尿病加重腦缺血損傷血管再生有著重要的調(diào)控作用。

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Effect of microRNA-155 on regulation of angiogenesis in diabetic rats with cerebral ischemic injury

HAN Jiang－quan1，LU Jun－jiang1，3，XIANG Can－h(huán)ui2，LIU Cheng－ling1，WANG Zhengyuan1，LIU Ling1，CHEN Ling1，F(xiàn)AN Ya－dan1

(1Department of Neurology，The Fifth Affiliated Hospital，2Experimental Center of Zhuhai Campus，Zunyi Medical College，Zhuhai 519100，China;3Special Medical Center of Zhujiang Hospital Affiliated to Southern Medical University，Guangzhou 510000，China.E-mail:gdshanjq@163.com)

AIM:To evaluate the effect of microRNA－155(miRNA－155)on the regulation of angiogenesis in diabetic rats with cerebral ischemic injury.METHODS:Adult male Sprague－Dawley rats were randomly divided into 5 groups:sham group，cerebral ischemia group，diabetic cerebral ischemia group，diabetic cerebral ischemia+miRNA－155 inhibitors group and diabetic cerebral ischemia+scramble group.Diabetes model was made by injection of streptozocin and permanent cerebral ischemic model was developed by suture－occluded method.The scores of neurological deficit and infarct volume were estimated at 24 h after cerebral ischemia.miRNA－155 level was detected by real－time polymerase chain reaction.The expression of platelet endothelial cell adhesion molecule－1(PECAM－1/CD31)and vascular endothelial growth factor(VEGF)was detected by Western blotting.RESULTS:miRNA－155 inhibitor significantly reduced miRNA－155 levels in the ischemic cortex(P＜0.05)，improved the scores of neurological deficit，reduced infarction size and upregulated the levels of CD31 and VEGF(P＜0.05).CONCLUSION:miRNA－155 has a critical role in the regulation of angiogenesis in diabetic rats with cerebral ischemia.Down－regulation of miRNA－155 using miRNA－155 inhibitor attenuates brain infarct injury in diabetic rats.

microRNA－155;Diabetes;Cerebral ischemia;Angiogenesis

R363.2+71

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.029

1000－4718(2015)02－354－05

2014－09－26

2014－11－27

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(黔科合J字LKZ［2012］13號(hào));廣東省珠海市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目(No.珠衛(wèi)

200880 )

△通訊作者Tel:0756－6276307;E－mail:gdshanjq@163.com