李強(qiáng)，郭壯波，伍光穎，李超霞，鐘志勇

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院第四附屬醫(yī)院，廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院1急診科，2檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510220;3廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，廣東 佛山 528248)

阿托伐他汀對(duì)急性心肌梗死大鼠內(nèi)皮微顆粒及心肌細(xì)胞凋亡的影響*

李強(qiáng)1△，郭壯波1，伍光穎1，李超霞2，鐘志勇3

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院第四附屬醫(yī)院，廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院1急診科，2檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510220;3廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，廣東 佛山 528248)

目的:探討阿托伐他汀(atorvastatin，AT)對(duì)大鼠急性心肌梗死早期內(nèi)皮微顆粒(endothial microparticles，EMP)及心肌細(xì)胞凋亡的影響。方法:將24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、心肌梗死組(MI組)和阿托伐他汀心肌梗死組(MI+AT組)，每組8只。采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎制作急性心肌梗死大鼠模型。分別在造模后2 h和24 h采外周血檢測(cè)肌酸激酶同工酶(creatine kinase－MB，CK－MB)、心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)和EMP，其中循環(huán)EMP用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。通過(guò)TUNEL檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果:造模后2 h，MI組大鼠的CK－MB表達(dá)水平較sham組大鼠顯著升高(P＜0.05);MI組及MI+AT組大鼠EMP表達(dá)水平及心肌細(xì)胞凋亡率上升，顯著高于sham組(P＜0.05)。造模后24 h，MI組大鼠EMP表達(dá)水平顯著高于sham組(P＜0.05);MI+ AT組大鼠CK－MB、cTnT、EMP表達(dá)水平及心肌細(xì)胞凋亡率較MI組顯著降低(P＜0.05)。此外，MI組大鼠的CKMB表達(dá)水平在造模后24 h較造模后2 h顯著升高(P＜0.05);MI+AT大鼠CK－MB、cTnT和EMP表達(dá)水平在造模后24 h較2 h顯著下降(P＜0.05)。結(jié)論:AT可降低大鼠急性心肌梗死時(shí)的EMP水平和心肌細(xì)胞凋亡率，提示AT對(duì)內(nèi)皮功能有保護(hù)作用。

急性心肌梗死;阿托伐他汀;內(nèi)皮微顆粒;心肌細(xì)胞凋亡

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病極為嚴(yán)重的臨床類型之一，是多種因素導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈內(nèi)斑塊糜爛及破裂、血栓形成、血管痙攣，使冠狀動(dòng)脈血供急劇減少甚至中斷，心肌發(fā)生嚴(yán)重而持久的缺血導(dǎo)致的心肌壞死。目前認(rèn)為血管內(nèi)皮功能障礙正是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)和始動(dòng)因素。內(nèi)皮微顆粒(endothelial microparticles，EMP)是內(nèi)皮細(xì)胞激活或凋亡時(shí)產(chǎn)生的膜性小囊泡，其水平的升高在包括冠狀動(dòng)脈疾病在內(nèi)的多種病理狀態(tài)中可見(jiàn)，并反映內(nèi)皮功能受損及臨床預(yù)后不良。他汀類作為抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物能明顯降低冠心病患者心血管事件的發(fā)生率，已廣泛應(yīng)用于冠心病患者的二級(jí)預(yù)防，但其改善冠心病患者預(yù)后的機(jī)制尚未完全闡明。本研究擬建立大鼠急性心肌梗死模型，通過(guò)檢測(cè)心肌梗死不同時(shí)段EMP、肌酸激酶同工酶(creatine kinase－MB，CK－MB)和心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)的動(dòng)態(tài)變化，并統(tǒng)計(jì)大鼠心肌缺血后心肌細(xì)胞凋亡率，揭示阿托伐他汀(atorvastatin，AT)對(duì)大鼠急性心肌梗死時(shí)內(nèi)皮的保護(hù)作用。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器

健康雄性SPF級(jí)SD大鼠24只，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK粵2013－0002)。根據(jù)體重隨機(jī)分為sham組、MI組、MI+AT組，每組8只。

阿托伐他汀鈣片(輝瑞愛(ài)爾蘭藥品公司);CKMB試劑盒(武漢華美生物科技);cTnT ELISA Kit (武漢華美生物科技);CD31－PE熒光標(biāo)記單抗、CD42b－FITC熒光標(biāo)記單抗(BD)。

7020 型全自動(dòng)生化分析儀(HITACHI)，流式細(xì)胞儀(BD)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組Sham組:大鼠進(jìn)行開(kāi)胸與穿線處理，但不結(jié)扎阻斷冠狀動(dòng)脈左前降支;MI組:在sham組的基礎(chǔ)上，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，結(jié)扎后不再?gòu)?fù)通;MI+AT組:在MI組的基礎(chǔ)上，給予阿托伐他汀溶液灌胃。

2.2 給藥方法造模前1 h進(jìn)行灌胃給藥，根據(jù)大鼠體重，灌胃劑量均為10 mg/kg，劑量參考文獻(xiàn)選擇［1］;sham組、MI組大鼠給予等量的0.9%氯化鈉溶液;MI+AT組大鼠給予阿托伐他汀溶液。

2.3 心肌梗死模型構(gòu)建大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉，剃去頸部和胸部毛發(fā)，以75%乙醇擦拭消毒頸部皮膚后作正中切口約1 cm，暴露氣管，進(jìn)行氣管插管并連接呼吸機(jī)(呼吸機(jī)工作條件為呼吸頻率70～80次/min，潮氣量7～8 mL，呼吸時(shí)間比為1∶1)。待大鼠呼吸與呼吸機(jī)同步后，測(cè)量大鼠心電圖基礎(chǔ)值。取心電圖無(wú)異常大鼠，消毒胸部皮膚后，剪開(kāi)皮膚并鈍性分離胸部肌肉直至暴露肋骨，剪開(kāi)第3、4根肋骨，擴(kuò)開(kāi)大鼠胸腔，充分暴露心臟。用眼科鑷撕開(kāi)大鼠心臟心包膜，尋找大鼠左心耳與動(dòng)脈圓錐，在左心耳與動(dòng)脈圓錐之間穿入0號(hào)線，結(jié)扎，以心電圖Ⅱ?qū)?lián)檢測(cè)，有典型缺血心電圖改變者判定冠狀動(dòng)脈左前降支成功結(jié)扎，可進(jìn)行下一步縫合或者復(fù)通操作。大鼠模型建立完畢后，逐層縫合大鼠肌肉和皮膚，擠出大鼠胸腔空氣后撤去呼吸機(jī)，歸籠單籠飼養(yǎng)。

2.4 標(biāo)本的采集與處理Sham組以穿線為造模結(jié)束時(shí)點(diǎn)，MI組、MI+AT組，以復(fù)通冠狀動(dòng)脈左前降支為造模結(jié)束時(shí)點(diǎn)，在造模結(jié)束后2 h及24 h，采集大鼠血清與血漿(檸檬酸鈉抗凝)，于－80℃保存?zhèn)溆?，隨后解剖取大鼠心臟，以4%中性甲醛固定。

2.5 指標(biāo)測(cè)定依照ELISA Kit說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清cTnT含量;用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清CK－MB含量;用流式細(xì)胞術(shù)［2］檢測(cè)血漿EMP含量，樣本加抗CD31－PE(按1∶100比例用PBS稀釋)和抗CD42b－FITC(按1∶200比例用PBS稀釋)各10 μL，然后加入50 μL血漿樣本，避光孵育30 min，孵育結(jié)束后加入1 000 μL PBS混勻待測(cè)，設(shè)定上機(jī)吸樣速度為中速，吸樣時(shí)間為30 s，上機(jī)檢測(cè)EMP，記錄CD31+/ CD42b－為EMP的量。

2.6 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡大鼠造模后2 h及24 h分別處死，取心臟固定后制備石蠟切片，依照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Roche)進(jìn)行操作，DAB染色，光學(xué)顯微鏡下每張切片選取具有代表性的3個(gè)視野，使用IPP 6.0軟件分別對(duì)凋亡細(xì)胞(細(xì)胞核呈棕色)和正常細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)不同大鼠心肌細(xì)胞的凋亡率。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 各組CK-MB的活性比較

造模后2 h，MI組大鼠的CK－MB水平較sham組大鼠顯著升高(P＜0.05);造模后24 h，MI+AT組CK－MB水平較MI組顯著下降(P＜0.05);各組間比較，sham組大鼠的CK－MB水平在造模后2 h與造模后24 h比較無(wú)顯著差異(P＞0.05);MI組大鼠的CK－MB水平在造模后24 h較2 h顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);MI+AT大鼠的CK－MB水平在造模后24 h較2 h顯著下降(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

2 ELISA檢測(cè)各組大鼠cTnT的水平

造模后2 h，MI組大鼠血清中cTnT的水平和Sham組相近，無(wú)顯著差異(P＞0.05);MI+AT組大鼠的cTnT水平高于MI組，但無(wú)顯著差異(P＞0.05)。造模后24 h，MI組大鼠血清中cTnT的水平高于sham組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);MI +AT組大鼠的cTnT水平低于MI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各組間cTnT的水平造模后2 h與造模后24 h的比較，sham組、MI組大鼠的cTnT水平在造模后2 h和造模后24 h比較均無(wú)明顯變化(P＞0.05)，MI+AT組大鼠的cTnT水平在造模后24 h較造模后2 h降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠CK-MB和cTnT的表達(dá)Table 1.The expression of CK－MB and cTnT in different groups(Mean±SD.n=8)

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組大鼠EMP水平

造模后2 h，MI組及MI+AT組大鼠的EMP水平上升，顯著高于sham組(P＜0.05)。造模24 h后，MI組大鼠的EMP水平顯著高于sham組(P＜ 0.05)。各組間比較，造模后24 h，MI+AT組大鼠的EMP水平較MI組顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);MI+AT組大鼠的EMP水平造模后24 h較造模后2 h明顯降低(P＜0.05)，見(jiàn)圖1、2及表2。

Figure 1.Scatter plot of flow cytometry analysis for EMP at 2 h after modeling in sham group，MI group and MI+AT group.圖1 造模后2 h sham組、MI組和MI+AT組EMP的流式細(xì)胞圖

4 TUNEL檢測(cè)各組SD大鼠心肌細(xì)胞凋亡率

造模后2 h MI組及MI+AT組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡率分別較sham組顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。造模后24 h，MI+AT組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡率比MI組顯著降低(P＜0.05)。各組間比較，MI+AT組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡率造模后24 h較造模后2 h明顯降低(P＜0.05)，見(jiàn)圖3、4及表2。

Figure 2.Scatter plot of flow cytometry analysis for EMP at 24 h after modeling in sham group，MI group and MI+AT group.圖2 造模后24 h sham組、MI組和MI+AT組的EMP流式細(xì)胞術(shù)散點(diǎn)圖

Figure 3.TUNEL staining at 2 h after modeling in sham group，MI group and MI+AT group(×400).圖3 造模后2 h sham組、MI組和MI+AT組大鼠心肌的TUNEL染色結(jié)果

Figure 4.TUNEL staining at 24 h after modeling in sham group，MI group and MI+AT group(×400).圖4 造模后24 h sham組、MI組和MI+AT組大鼠心肌的TUNEL染色結(jié)果

表2 各組大鼠血清中EMP水平和心肌細(xì)胞凋亡率的比較Table 2.The expression of EMP and myocardial apoptotic rate in different groups(Mean±SD.n=8)

討論

EMP是內(nèi)皮細(xì)胞激活或凋亡時(shí)釋放的一種膜性囊泡。目前普遍認(rèn)為EMP不僅是存在于循環(huán)中的內(nèi)皮細(xì)胞脫落的碎片，而且通過(guò)其表面不同蛋白分子與靶細(xì)胞相互作用起到信息傳遞的作用，并參與到許多與循環(huán)系統(tǒng)疾病相關(guān)的病理生理過(guò)程中。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，EMP在急性冠脈綜合征患者中顯著升高，而內(nèi)皮功能受損恰恰與EMP升高相關(guān)［3－7］，表明EMP能直接反映內(nèi)皮細(xì)胞在受到不良因素刺激時(shí)生物表型的變化，是敏感、可靠的內(nèi)皮功能障礙的生化指標(biāo)［8］。因此穩(wěn)定細(xì)胞膜降低EMP的釋放被認(rèn)為是血管疾病治療的有效靶點(diǎn)［9］。他汀類藥物是指南強(qiáng)烈推薦的調(diào)脂藥，不僅具有調(diào)脂作用，還具有抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激、改善血管內(nèi)皮功能、穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊等多種獨(dú)立于調(diào)脂作用外的“多效性”［10－11］。阿托伐他汀屬于他汀類調(diào)脂藥，是具有較強(qiáng)的羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制作用的新一代他汀類藥物。近年研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀除具有調(diào)脂作用外還通過(guò)影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞增殖，發(fā)揮改善內(nèi)皮功能失調(diào)、抑制炎癥反應(yīng)、抗血栓形成、穩(wěn)定斑塊等心血管保護(hù)作用［12］。阿托伐他汀還被證實(shí)可以通過(guò)增強(qiáng)和改善冠狀動(dòng)脈及外周動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的功能，從而減少梗死面積［13］，使缺血心肌組織得到有效再灌注。有關(guān)阿托伐他汀的ARMYDARECAPTURE研究［14］證實(shí)了他汀類藥物為冠心病患者帶來(lái)的益處。本研究顯示造模后2 h，MI組及MI +AT組大鼠的EMP水平上升，顯著高于sham組，而造模后24 h，MI+AT組大鼠的EMP水平及心肌細(xì)胞凋亡率較MI組則顯著降低，減輕EMP介導(dǎo)的內(nèi)皮損傷過(guò)程，提示阿托伐他汀有助于改善內(nèi)皮功能。

凋亡是一種多基因控制的自身程序性細(xì)胞死亡。早期的研究表明，它是心肌梗死早期細(xì)胞死亡的主要方式及梗死面積擴(kuò)大的原因之一，并認(rèn)為其心肌梗死面積的大小與心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡程度有關(guān)。Sun等［15］發(fā)現(xiàn)缺血后再灌注時(shí)間延長(zhǎng)能降低心肌梗死面積，這種心臟保護(hù)作用可能是通過(guò)抗凋亡機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。故如能早期干預(yù)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，有利于改善MI后的心室功能。既往已有研究報(bào)道阿托伐他汀可以顯著改善心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡、心肌重塑及心臟功能，發(fā)揮它降脂外的多重作用［16－19］。阿托伐他汀通過(guò)抑制MI心肌細(xì)胞凋亡，提高左心室射血分?jǐn)?shù)，降低左心室舒張末內(nèi)徑，改善心臟功能。B?cklund等［16］還發(fā)現(xiàn)梗死相關(guān)動(dòng)脈閉塞組患者的心肌細(xì)胞凋亡率顯著高于梗死相關(guān)動(dòng)脈開(kāi)通組，梗死相關(guān)動(dòng)脈通暢后顯著降低急性MI后晚期的心肌細(xì)胞凋亡率，顯著改善了MI患者的長(zhǎng)期預(yù)后。Sun等［15］發(fā)現(xiàn)缺血后再灌注時(shí)間延長(zhǎng)能降低心肌梗死面積，這種心臟保護(hù)作用可能是通過(guò)抗凋亡機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。本研究顯示MI+AT組大鼠的CK－MB、cT－nT表達(dá)水平及心肌細(xì)胞凋亡率均顯著低于MI組，也證實(shí)了AT的心血管保護(hù)作用。

本研究因條件所限，僅通過(guò)檢測(cè)血漿EMP及心肌細(xì)胞凋亡率的變化闡述阿托伐他汀對(duì)內(nèi)皮的保護(hù)作用。近來(lái)有研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在血管受損的條件下可被誘導(dǎo)歸巢至受損血管區(qū)域，進(jìn)而參與血管新生修復(fù)［20］。EPCs數(shù)量已被作為心血管疾病診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)［21］。而阿托伐他汀有增加循環(huán)系統(tǒng)EPCs數(shù)量、促進(jìn)損傷內(nèi)皮修復(fù)、穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊等功能，如能聯(lián)合檢測(cè)血漿EMP及EPCs數(shù)量或可進(jìn)一步證實(shí)阿托伐他汀的內(nèi)皮保護(hù)作用，有望成為今后的研究熱點(diǎn)。

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Effects of atorvastatin on release of endothelial microparticles and myocardial apoptosis in rats with acute myocardial infarction

LI Qiang1，GUO Zhuang－bo1，WU Guang－ying1，LI Chao－xia2，ZHONG Zhi－yong3

(1Department of Emergency，2Clinical Laboratory，Guangzhou Red Cross Hospital，the Fourth Affiliated Hospital，School of Medicine，Jinan University，Guangzhou 510220，China;3Medical Laboratory Animal Center of Guangdong Province，F(xiàn)oshan 528248，China.E-mail:wliqiang@163.com)

AIM:To investigate the effect of atorvastatin(AT)on the release of endothelial microparticles (EMP)and myocardial apoptosis in the rats with myocardial infarction.METHODS:SD male rats(n=24)were randomly divided into 3 groups:sham operation(sham)group，myocardial infarction(MI)group and MI+AT group.The rat model of acute myocardial infarction was prepared by coronary artery ligation.At 2 h and 24 h after modeling，the peripheral blood was collected to detect creatine kinase－MB(CK－MB)and cardiac troponin T(cTnT).The circulating levels of EMP were measured by flow cytometry.The myocardial apoptosis was detected by terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling(TUNEL)assay.RESULTS:At 2 h after modeling，the level of CK－MB was significantly increased in MI group compared with sham group，and the level of EMP and the myocardial apoptotic rate were significantly increased in MI group and MI+AT group compared with sham group.At 24 h after modeling，the level of EMP was significantly increased in MI group compared with sham group.The levels of CK－MB，cTnT，EMP and the myocardial apoptotic rate were significantly decreased in MI+AT group compared with MI group.Moreover，the level of CK－MB in MI group was significantly increased at 24 h compared with that at 2 h after modeling.The levels of CK－MB，cTnT and EMP were significantly decreased in MI+AT group at 24 h compared with those at 2 h after modeling.CONCLUSION:Ator－vastatin may reduce the level of EMP and the myocardial apoptotic rate in the rats with acute myocardial infarction，indicating that atorvastatin plays a role in protecting endothelium.

Acute myocardial infarction;Atorvastatin;Endothelial microparticles;Cardiomyocyte apoptosis

R542.2+1;R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.030

1000－4718(2015)02－359－06

2014－12－03

2014－12－16

廣東省科技計(jì)劃(No.2012B061700016)

△通訊作者Tel:020－34403518;E－mail:wliqiang@163.com