賴煥玲，梁志健，吳清和，黃萍，操紅纓

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006)

·實(shí)驗(yàn)技術(shù)·

不同灌注速度及方法對(duì)大鼠膀胱容量、壓力及神經(jīng)傳入電活動(dòng)測(cè)定的影響*

賴煥玲，梁志健，吳清和，黃萍，操紅纓△

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006)

目的:探討不同灌注速度及方法對(duì)大鼠膀胱容量、壓力及神經(jīng)傳入電活動(dòng)測(cè)定的影響。方法:SD雌性大鼠隨機(jī)分為2組，分別選用尿道插管法及膀胱頂造瘺法，以50、100、200和400 μL/min的速度進(jìn)行灌注，以尿動(dòng)力儀觀察灌注過程中膀胱容量及壓力的變化，以多通道生理記錄儀檢測(cè)灌注過程中膀胱神經(jīng)傳入電活動(dòng)的變化。結(jié)果:采用插管法進(jìn)行灌注測(cè)得最大放電頻率，其隨速度的升高呈上升趨勢(shì);膀胱漏尿點(diǎn)壓(BLPP)和最大膀胱排尿壓(MVP)隨著灌注速度的升高而增大;各灌注速度下膀胱最大容量(MBC)無顯著變化。造瘺法以各速度測(cè)得最大放電頻率均無顯著變化;其MBC隨速度升高呈下降趨勢(shì)，且在200及400 μL/min灌注時(shí)顯著降低;其BLPP及MVP無明顯變化。2種方法相比，放電頻率基線值無顯著差異，以100、200和400 μL/min進(jìn)行灌注時(shí)造瘺法測(cè)得的膀胱最大放電頻率均低于插管法;以不同速度灌注，造瘺法測(cè)得的MBC均比插管法小;而以50和100 μL/min進(jìn)行灌注時(shí)，造瘺法測(cè)得的壓力比插管法高。結(jié)論:插管法以不同速度進(jìn)行灌注并未對(duì)膀胱容量造成明顯變化，但其膀胱壓力及神經(jīng)放電頻率隨速度升高，使用此法應(yīng)根據(jù)研究目的選擇灌注速度;采用造瘺法在200及400 μL/ min的灌注速度時(shí)，膀胱容量明顯減少，故采用該法時(shí)建議以＜200 μL/min的速度進(jìn)行灌注。

灌注速度;尿道插管術(shù);膀胱頂造瘺;膀胱容量;膀胱壓力

膀胱的主要生理功能是儲(chǔ)尿與排尿。正常的膀胱感覺功能是實(shí)現(xiàn)膀胱儲(chǔ)尿和排尿生理過程的基礎(chǔ)，且該過程有賴于神經(jīng)系統(tǒng)、膀胱逼尿肌和尿道括約的協(xié)調(diào)。膀胱感覺功能實(shí)際上是大腦皮層對(duì)來自下尿路傳入神經(jīng)沖動(dòng)的主觀感知和整合［1］，主要對(duì)下尿路牽張所引起的膨脹、溫度、痛覺和傷害性刺激產(chǎn)生主觀感知。排尿欲是非自主控尿轉(zhuǎn)向自主控尿的標(biāo)志。膀胱的機(jī)械敏感性所表現(xiàn)出的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)的變化以及在絕對(duì)水平上對(duì)刺激和尿液形成的反應(yīng)依賴于逼尿肌在低速膨脹過程中的適應(yīng)性變化。膀胱膨脹(充盈)速度可以嚴(yán)重影響膀胱測(cè)壓的測(cè)定結(jié)果［2］。國(guó)際尿控協(xié)會(huì)規(guī)定，人體采用慢速充盈既速度低于10 mL/min作為生理性充盈。Shea等［3］的研究曾采用生理鹽水以100 μL/min的速度模擬生理性充盈進(jìn)行大鼠膀胱灌注。膀胱內(nèi)灌注藥物［4］已經(jīng)是一種治療膀胱相關(guān)疾病的手段，適宜的灌注速度及灌注方法不僅能正確反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果且能為膀胱相關(guān)疾病的治療服務(wù)，因此，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究設(shè)計(jì)了4個(gè)速度:50、100、200和400 μL/min，并采用目前國(guó)內(nèi)外常用的尿動(dòng)力學(xué)［5］膀胱測(cè)壓方法——插管法［6－7］及造瘺法［8］進(jìn)行灌注，觀察灌注過程中膀胱容量、壓力及膀胱傳入電活動(dòng)的變化，擬初步探討灌注的不同速度及方法對(duì)膀胱功能的影響，為獲得適宜的灌注速度及灌注方法提供依據(jù)。

材料和方法

1 動(dòng)物、主要藥品與儀器

SPF級(jí)SD大鼠，雌性，200～220 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(粵) 2013－0020，合格證號(hào)為440005900000600，飼養(yǎng)在溫度(24±2)℃、濕度50%～70%的條件下，采用12 h晝夜間斷照明。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施許可證號(hào)為SYXK (粵)2013－0085，使用證明號(hào)為00058727。

氯化鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠);烏拉坦(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);BL420E型多通道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都泰盟科技儀器有限公司);Laborie UDS－94型尿動(dòng)力學(xué)檢查儀(Laborie);WZ－50C6型微量注射泵(浙江史密斯醫(yī)學(xué)儀器有限公司);測(cè)壓導(dǎo)管(測(cè)壓導(dǎo)管為測(cè)壓接頭連接3F硬膜外麻醉導(dǎo)管改造而成)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組20只雌性SD大鼠隨機(jī)分為2組:造瘺法組采取導(dǎo)管經(jīng)膀胱頂造瘺導(dǎo)入膀胱的方法進(jìn)行灌注;插管法組采取導(dǎo)管沿尿道導(dǎo)入膀胱的方法進(jìn)行灌注。每組10只，2組動(dòng)物均以50、100、200和400 μL/min的速度分別進(jìn)行灌注。

2.2 盆神經(jīng)分離［3，8］大鼠以25%烏拉坦(1.0 g/ kg)全麻后，打開腹腔，輕輕推開腹腔腸道暴露后腹膜和盆腔腹膜。玻璃分針劃開后腹膜，沿盆神經(jīng)節(jié)向中樞端分離盆神經(jīng)(盆神經(jīng)直徑約0.3 mm，長(zhǎng)10～15 mm)。將腸道及一側(cè)子宮輕推至另一側(cè)后，可在髂血管分叉下方和膀胱后方形成一個(gè)類似三角形的凹陷空間，滴加37℃溫石油浸泡盆神經(jīng)，保溫防干，同時(shí)便于將盆神經(jīng)懸掛于電極而不與周圍組織接觸。分離好的大鼠盆神經(jīng)懸掛于雙鉤鉑絲電極，參考電極連接于皮膚。通過加熱兔臺(tái)將大鼠肛溫控制在37℃左右。

2.3 膀胱容量、壓力及神經(jīng)放電記錄打開BL420E型多通道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，設(shè)置好實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ郊皽y(cè)量參數(shù)后，連接電極。用螺旋調(diào)節(jié)器調(diào)整記錄電極與盆神經(jīng)的接觸位置，觀察盆神經(jīng)放電波形，以信噪比高、基線穩(wěn)定、干擾少為效果佳。記錄盆神經(jīng)傳入放電前，用眼科彎鑷夾斷盆神經(jīng)中樞端，減少中樞端傳入電活動(dòng)的影響［6］。

2.3.1 插管法沿尿道口緩緩導(dǎo)入3F導(dǎo)管。3F導(dǎo)管通過T型轉(zhuǎn)換接頭連接膀胱測(cè)壓管和灌注管，測(cè)壓管連接尿動(dòng)力儀壓力傳感器，灌注管連接微量灌注泵。排空膀胱，待盆神經(jīng)自發(fā)傳入放電恢復(fù)至基線水平，再按不同速度由低到高進(jìn)行灌注(每次灌注前需待神經(jīng)放電恢復(fù)至基線水平)，記錄灌注時(shí)間、膀胱壓力及神經(jīng)傳入電活動(dòng)情況，具體方法如下:體內(nèi)置零，灌注前記錄盆神經(jīng)自發(fā)傳入放電基線開啟微量注射泵向膀胱內(nèi)灌注生理鹽水，此過程中注意觀察尿道外口有無液體溢出。液體溢出時(shí)記錄的膀胱壓即為膀胱漏尿點(diǎn)壓(bladder leak point pressures，BLPP);同時(shí)停止灌注，觀察膀胱壓力曲線，記錄其峰值，即為最大膀胱排尿壓(maximum voiding pressure，MVP);記錄此過程中膀胱神經(jīng)傳入電活動(dòng)，即盆神經(jīng)放電，包括基線值及最大放電頻率，直至排尿過程完成后停止。計(jì)算膀胱最大容量(maximum bladder capacity，MBC)，MBC=灌注時(shí)間×灌注速度。

2.3.2 造瘺法于膀胱頂切開一小口，插入3F導(dǎo)管，2－0絲線結(jié)扎。此過程中注意切勿夾持膀胱以免對(duì)膀胱壁造成損傷。導(dǎo)管連接T型轉(zhuǎn)換接頭，其余操作與插管法一致。

2.4 參數(shù)設(shè)置模式(生物電)，采樣頻率(10 kHz)，掃描速度(2 s/div)，靈敏度(20 μV)，時(shí)間常數(shù)(0.001 s)，高頻濾波(3 kHz)，50 kHz陷波(打開)。

2.5 放電頻率分析用BL420E多通道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，以1∶1信噪比為閾值分析;記錄60 s內(nèi)的基線平均放電頻率作為基線值(baseline)，充盈過程中放電頻率最大值(10 s內(nèi)平均值)作為最大放電頻率(maximum firing frequency)。首先確認(rèn)盆神經(jīng)的定位及功能是否正常，對(duì)膀胱進(jìn)行緩慢灌注(30 μL/min)充盈，可誘發(fā)盆神經(jīng)傳入放電頻率進(jìn)行性增強(qiáng)，表明盆神經(jīng)無明顯損傷，放電活動(dòng)正常。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析(One－way ANOVA);以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 膀胱傳入電活動(dòng)變化

研究結(jié)果顯示，2種方法比較，雖然造瘺法以50 μL/min的速度灌注時(shí)最大放電頻率及膀胱容量均比插管法低，但未顯示出顯著差異，而其它速度灌注時(shí)與插管法比較，各指標(biāo)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)，因此本研究以最低速度50 μL/min模擬生理性充盈速度，作為對(duì)照。

采用插管法以100 μL/min進(jìn)行灌注，動(dòng)物排尿過程中最大放電頻率與采用50 μL/min進(jìn)行灌注時(shí)無顯著變化，而采用200 μL/min及400 μL/min進(jìn)行灌注時(shí)，其最大放電頻率顯著升高(P＜0.05)。采用造瘺法以100、200和400 μL/min進(jìn)行灌注，其最大放電頻率與采用50 μL/min進(jìn)行灌注時(shí)均無顯著變化。2種方法相比，其基線值無顯著差異，但采用造瘺法以100、200和400 μL/min進(jìn)行灌注，其最大放電頻率與插管法相比，均顯著下降(P＜0.05)，見表1。

表1 不同灌注速度及方法對(duì)盆神經(jīng)放電的影響Table 1.The effects of different speeds and ways of instillation on pelvic nerve firing(Mean±SD.n=10)

2 膀胱容量、壓力變化

采用插管法以不同速度進(jìn)行灌注，其膀胱最大容量比較穩(wěn)定，無顯著變化;膀胱壓力(BLPP及MVP)隨著灌注速度的升高而增大，其中以100、200和400 μL/min進(jìn)行灌注組比50 μL/min灌注組均高(P＜0.01)。采用造瘺法隨灌注速度增加，其MBC呈下降趨勢(shì)，其中以400 μL/min灌注組MBC比50 μL/min灌注組少(P＜0.05);膀胱壓力(BLPP及MVP)在不同灌注速度間無明顯變化。2種方法比較，造瘺法不同灌注速度測(cè)得的MBC均比插管法小(P＜0.05)，但在50和100 μL/min灌注組，造瘺法測(cè)得的壓力比插管法高(P＜0.05)，見表2。

表2 不同灌注速度及方法對(duì)膀胱容量、壓力的影響Table 2.The effects of different speeds and ways of instillation on bladder volume and pressure(Mean±SD.n=10)

3 插管法和造瘺法在不同速度下盆神經(jīng)放電及膀胱壓力圖的變化

2種方法的不同速度灌注生理鹽水，所記錄的神經(jīng)放電頻率變化均呈現(xiàn)出的反應(yīng)模式為:放電頻率先于壓力達(dá)到峰值，而后壓力達(dá)到峰值時(shí)，放電頻率趨于平臺(tái)或下降［3］。從圖1、2中的尿動(dòng)力曲線圖可見，采用插管法以不同速度進(jìn)行灌注，儲(chǔ)尿期逼尿肌收縮峰比造瘺法要少，可能因?yàn)橥暾陌螂妆诮Y(jié)構(gòu)有助于降低逼尿肌對(duì)容量刺激產(chǎn)生的不穩(wěn)定收縮，防止排尿提前。

Figure 1.The diagram of pelvic nerve firing and bladder pressure with urethra insertion.A:speed at 50 μL/min;B:speed at 100 μL/min;C:speed at 200 μL/min;D:speed at 400 μL/min.圖1 插管法不同速度盆神經(jīng)放電及膀胱壓力示意圖

Figure 2.The diagram of pelvic nerve firing and bladder pressure with bladder dome insertion.A:speed at 50 μL/min;B:speed at 100 μL/min;C:speed at 200 μL/min;D:speed at 400 μL/min.圖2 造瘺法不同速度盆神經(jīng)放電及膀胱壓力示意圖

討論

膀胱由復(fù)雜且分布廣泛的神經(jīng)支配。交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)傳出纖維分別通過下腹神經(jīng)和盆腔內(nèi)臟神經(jīng)傳至膀胱和尿道［2］。在膀胱測(cè)壓充盈膀胱過程中，可能存在3種明顯的感覺［9］:充盈初感、初排尿欲、強(qiáng)烈排尿欲。充盈初感可能只有在人為膀胱充盈時(shí)才被發(fā)覺，此感覺很弱，不恒定，可能依賴于皮層對(duì)其感受的波動(dòng)。與排尿欲相關(guān)的沖動(dòng)走行于盆神經(jīng)內(nèi)，排尿欲望來自于膀胱壁的牽張。而逼尿肌的收縮在儲(chǔ)尿排尿過程中也并非一成不變的［10］:在充盈過程中，逼尿肌的收縮表現(xiàn)為肌源性及自發(fā)性，發(fā)生在逼尿肌細(xì)胞或小單元;而排尿過程中，逼尿肌呈整體協(xié)調(diào)性收縮，以排空膀胱。膀胱充盈越快，膀胱順應(yīng)性越低，逼尿肌不穩(wěn)定收縮發(fā)生率越高，有效膀胱容量越小，越容易產(chǎn)生贗象［2］。Daly等［11］研究結(jié)果也顯示高速灌注對(duì)逼尿肌形成的刺激，可能使其產(chǎn)生不穩(wěn)定收縮或排尿提前。本研究以50 μL/min的速度作為參照，結(jié)果顯示，插管法不同速度對(duì)膀胱容量未造成明顯影響，而逐漸升高的充盈速率使得盆神經(jīng)放電及膀胱內(nèi)壓的升高，與國(guó)外研究結(jié)果相符［11］。而采用造瘺法的動(dòng)物，其膀胱容量隨著速度的增加呈下降趨勢(shì)，且在200及400 μL/min的速度顯示出顯著差異;其膀胱壓力及神經(jīng)傳入電活動(dòng)在各速度間無明顯變化?？赡苡捎谠殳浭中g(shù)使得神經(jīng)體細(xì)胞沉默單元的機(jī)械刺激感受器及化學(xué)刺激感受器受損所致［3］。

Birder等［12］采用動(dòng)物在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，顯示出C纖維對(duì)造瘺膀胱膨脹雖無明顯的反應(yīng)，但認(rèn)為感覺傳入電活動(dòng)的小幅度降低可能是由C纖維引起的，其機(jī)制尚未明確。Yoshimura等［13］研究表明，膀胱的感覺神經(jīng)傳入纖維包含有髓鞘的Aδ纖維和無髓鞘的C纖維。在鼠膀胱已證實(shí)Aδ纖維僅對(duì)膀胱充盈產(chǎn)生反應(yīng)，表現(xiàn)為容量受體特性，對(duì)膀胱黏膜的牽張敏感。C纖維相對(duì)Aδ纖維具有高機(jī)械性閾值特征［14］。Szallasi等［15］研究發(fā)現(xiàn)無髓鞘感覺神經(jīng)纖維(C纖維)存在多種活性成分，其中包括降鈣素基因相關(guān)肽(calcitoningene－relatedpeptide，CGRP)、P物質(zhì)、血管活性腸肽、Y物質(zhì)、ATP以及乙酰膽堿等。雖然Gabella等［16］發(fā)現(xiàn)膀胱頂黏膜沒有傳入軸突，但造瘺帶來的痛覺和傷害可能會(huì)激活C纖維致使逼尿肌對(duì)容量敏感性增加，提前收縮以完成排尿過程減少膀胱負(fù)荷，此機(jī)制仍需進(jìn)一步研究;另一方面由于造瘺破壞了膀胱肌叢(myovesical plexus)的完整性可能導(dǎo)致興奮的過度傳入或抑制不足引起膀胱自主性活動(dòng)過度增強(qiáng)［17］。

生理性水平的膨脹不會(huì)對(duì)膀胱容量造成影響，但如果灌注速率超出了正常膀胱尿液形成的速率水平，便會(huì)形成非生理性的傷害。病理性的改變?nèi)缫蚣膊「淖兞吮颇蚣?duì)容量的適應(yīng)性或因逼尿肌過度敏感，會(huì)使其在較小的尿液容量水平時(shí)產(chǎn)生收縮［11］。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果及已有研究，插管法以不同速度進(jìn)行灌注并未對(duì)膀胱容量造成明顯變化，但其膀胱內(nèi)壓及神經(jīng)放電頻率隨速度升高，使用此法應(yīng)根據(jù)研究目的選擇灌注速度;而造瘺法以50和100 μL/min速度進(jìn)行灌注對(duì)膀胱傳入電活動(dòng)、容量及膀胱內(nèi)壓無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，200及400 μL/min的灌注速度使膀胱容量明顯下降，可見該速度已經(jīng)造成了非生理性刺激，使用此法進(jìn)行研究應(yīng)選用低于200 μL/min的速度進(jìn)行灌注。

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Effects of different speeds and ways of instillation on bladder volume，pressure and pelvic nerve firing

LAI Huan－ling，LIANG Zhi－jian，WU Qing－h(huán)e，HUANG Ping，CAO Hong－ying

(
Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China.E-mail:hycao@gzucm.edu.cn)

AIM:To investigate the changes of bladder volume，pressures and pelvic nerve firing induce by different speeds and ways of instillation.METHODS:Female SD rats(n=20)were randomly divided into 2 groups.The rats in group A was performed using 3－F polyethylene tubing inserted into the bladder through the urethra.The rats in group B were performed using 3－F tubing inserted into the dome of the bladder and secured by silk suture.The rats in both groups were infused with saline into the bladder at different speeds of 50，100，200 and 400 μL/min.The changes of bladder volume and pressure were recorded by urodynamic measuring devices.The changes of pelvic nerve firing during instillation were recorded by multi－channel physiologic recorder.RESULTS:In group A，the maximum firing frequency，bladder leak point pressure(BLPP)and maximum voiding pressure(MVP)were increased with the increase in the instillation speed.No significant difference of the maximum bladder capacity(MBC)at different speeds was observed.In group B，the maximum firing frequency had no significant difference at different speeds.MBC was decreased with the increase in the instillation speed，and exhibited significant decrease at 200 and 400 μL/min.No significant difference of BLPP and MVP at different speeds was observed.Compared with group A，the maximum firing frequency and MBC in group B significantly decreased at different speeds.However，BLPP and MVP in group B were higher than those in group A at the speeds of 50 and 100 μL/min.CONCLUSION:Different instillation speeds with the method of group A will not change the bladder volume but influence the pelvic nerve firing，so the process of method A may take various speeds according to different aims.However，process of method B at the speed of over 200 μL/min may not be good to MBC，thus instillation under 200 μL/min is re－commended.

Instillation speed;Urethral catheterization;Bladder dome insertion;Bladder capacity;Bladder pressure

R33－33

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.034

1000－4718(2015)02－379－06

2014－09－28

2014－10－29

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81202982)

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