段艷芳(本刊記者)

酵母剪接體高分辨率三維結(jié)構(gòu)的解析

段艷芳(本刊記者)

2015年8月21日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院施一公教授帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)在美國(guó)《科學(xué)》雜志上同時(shí)發(fā)表了兩篇論文——《3.6 ?的酵母剪接體結(jié)構(gòu)》(Structure of a yeast spliceosome at 3.6-Angstrom resolution)和《前體信使RNA剪接的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)》(Structural basis of pre-mRNA splicing)，介紹了通過(guò)單顆粒冷凍電子顯微技術(shù)(冷凍電鏡)解析的酵母剪接體(spliceosome)在3.6 ?分辨率的三維結(jié)構(gòu)，并在此結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行詳細(xì)分析，闡述了剪接體對(duì)前體信使RNA (pre-mRNA)執(zhí)行剪接的基本工作機(jī)理。該項(xiàng)工作將分子生物學(xué)的“中心法則”在分子機(jī)理的研究上大幅度向前推進(jìn)，是我國(guó)科學(xué)家在生命科學(xué)領(lǐng)域做出的重大原創(chuàng)性突破。

首次獲得剪接體近原子分辨率的高清結(jié)構(gòu)圖

剪接是轉(zhuǎn)錄后修飾的重要環(huán)節(jié)，是指在真核生物RNA中將非編碼的內(nèi)含子(intron)序列去除，將編碼的外顯子(exon)序列連接起來(lái)的過(guò)程。真核生物編碼蛋白質(zhì)的前體信使RNA剪接過(guò)程需要剪接體的參與。剪接體是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、復(fù)雜的RNA-蛋白質(zhì)大分子復(fù)合物，沉降系數(shù)大約為60S，由U1、U2、U4、U5、U6等5個(gè)核內(nèi)小核糖核蛋白(snRNP)和多種其他蛋白質(zhì)所組成。每個(gè)snRNP包含一條核內(nèi)小RNA(snRNA)和數(shù)個(gè)或十多個(gè)蛋白質(zhì)。更為重要的是，伴隨著不同snRNP的結(jié)合與解離，剪接體行使拼接功能是一個(gè)復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的拼接過(guò)程。首先，U1結(jié)合至內(nèi)含子的5′拼接點(diǎn)形成復(fù)合物E，然后U2結(jié)合至分支點(diǎn)(branch site，BS)形成復(fù)合物A，接下來(lái)U4/U6. U5三聚snRNP裝配上去形成復(fù)合物B。伴隨著U1、U4的陸續(xù)解離，剪接體最終成為處于激活狀態(tài)的復(fù)合物Bact和具有催化活性的復(fù)合物B*。U6/U2催化酯轉(zhuǎn)移反應(yīng)，5′拼接點(diǎn)斷開(kāi)，內(nèi)含子形成套索結(jié)構(gòu)，標(biāo)志著第一階段催化反應(yīng)的完成，形成包含有U2、U5、U6和內(nèi)含子套索的復(fù)合物C。接下來(lái)完成第二階段的酯轉(zhuǎn)移反應(yīng)，內(nèi)含子3′位點(diǎn)斷開(kāi)，外顯子連接在一起(圖1)。

施一公團(tuán)隊(duì)解析的是包含有U2和U5 snRNP，NTC，NTC相關(guān)蛋白，U6 snRNA，以及一個(gè)RNA內(nèi)含子套索的剪接體三維結(jié)構(gòu)。該復(fù)合物包括源于37個(gè)蛋白質(zhì)的10 574個(gè)氨基酸和4條RNA分子，總分子量高達(dá)130萬(wàn)Da。從酵母剪接體高分辨率的三維結(jié)構(gòu)中可以看出，剪接體的外形輪廓十分不對(duì)稱(chēng)，各個(gè)蛋白相互纏繞，形成了分子量和體積都很巨大的復(fù)合物(圖2)。U5 snRNP起到了中心支架的作用，U6和U2 RNA相互纏繞形成催化中心。剪接體本質(zhì)上是蛋白質(zhì)指引的核酶，控制關(guān)鍵RNA的位置和距離，從而控制剪接反應(yīng)。

這是首次在近原子分辨率上看到了剪接體的細(xì)節(jié)，而且解析對(duì)象是在真核生物體內(nèi)真正發(fā)揮作用的完整的剪接體，因此意義重大。論文發(fā)表后，施一公表示這項(xiàng)研究成果的意義很可能超過(guò)了自己過(guò)去25年科研生涯中所有研究成果的總和。

自1977年Richard J. Roberts和Phillip A. Sharp分別發(fā)現(xiàn)真核生物斷裂基因，并因此榮獲1993年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)以來(lái)，對(duì)RNA剪接的研究不斷深入，剪接體的結(jié)構(gòu)解析是分子生物學(xué)里最熱門(mén)的研究之一。國(guó)際上多家實(shí)驗(yàn)室也進(jìn)行著類(lèi)似的研究，如劍橋大學(xué)Kiyoshi Nagai團(tuán)隊(duì)、德國(guó)的Reinhard Lührmann團(tuán)隊(duì)、美國(guó)馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Melissa Moore團(tuán)隊(duì)、哈佛大學(xué)的Robin Reed團(tuán)隊(duì)等，競(jìng)爭(zhēng)非常激烈。例如，此前已有多個(gè)課題組利用冷凍電鏡獲得了一系列剪接體復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)，只是分辨率在20～50 ?，無(wú)法看清細(xì)節(jié)。2015年6月24日，劍橋大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的日裔學(xué)者Kiyoshi Nagai博士的課題組在《自然》雜志上發(fā)表文章，解析了釀酒酵母的U4/U6.U5三聚snRNP在5.9 ?的分辨率的三維結(jié)構(gòu)，一度引起轟動(dòng)。Nagai的最新工作被稱(chēng)為近原子尺度的結(jié)構(gòu)研究。施一公團(tuán)隊(duì)不但將分辨率提高至3.6 ?，可以將絕大部分氨基酸看得清楚楚楚，而且解析對(duì)象是完整的剪接體，因而是一項(xiàng)重大突破。該成果闡釋清楚了剪接體對(duì)前體mRNA執(zhí)行剪接的基本工作原理，不僅初步解答了這一基礎(chǔ)生命科學(xué)領(lǐng)域長(zhǎng)期以來(lái)備受關(guān)注的核心問(wèn)題，也為進(jìn)一步揭示與剪接體相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和理論指導(dǎo)。

圖1 剪接體行使pre-mRNA剪接功能是個(gè)復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的過(guò)程[3]。施一公團(tuán)隊(duì)解析了完成第一步催化反應(yīng)，包含U2、U5、U6 snRNP，內(nèi)含子套索結(jié)構(gòu)和其他蛋白質(zhì)的剪接體的三維結(jié)構(gòu)

圖2 施一公團(tuán)隊(duì)解析的酵母剪接體在3.6 ?分辨率的三維結(jié)構(gòu)圖[1]

對(duì)RNA剪接研究具有重要的推動(dòng)作用

RNA剪接對(duì)真核生物基因表達(dá)調(diào)控具有重要的意義。不編碼的內(nèi)含子序列通過(guò)剪接被精確而高效地去除，才能被翻譯成具有正常功能的蛋白質(zhì)，而且越是高等的生物，內(nèi)含子越多，剪接也越復(fù)雜。更為重要的是，真核生物中還普遍存在著選擇性剪接，即一個(gè)基因的前體mRNA可以形成多種mRNA產(chǎn)物，從而形成不同的蛋白質(zhì)，發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。選擇性剪接顯著提高了基因組的復(fù)雜性，是基因表達(dá)調(diào)控的重要方式。例如，昆蟲(chóng)的性別決定即由選擇性剪接級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控。剪接是一個(gè)至關(guān)重要的生物學(xué)機(jī)制——至少15%的人類(lèi)疾病是由于剪接錯(cuò)誤所致。例如，脊髓性肌萎縮(一種影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的常染色體隱性遺傳病)和色素性視網(wǎng)膜炎(一種會(huì)導(dǎo)致失明的常見(jiàn)疾病)，均與RNA剪接不能正常進(jìn)行密切相關(guān)。

通過(guò)間接實(shí)驗(yàn)，科學(xué)家對(duì)剪接體如何發(fā)揮作用已經(jīng)有了比較深入的了解。這一次是實(shí)實(shí)在在地“看到”剪接體的各個(gè)部分，不同snRNP如何結(jié)合在一起并行使功能的，把RNA剪接相關(guān)研究向前推進(jìn)了一大步。近原子分辨率剪接體三維結(jié)構(gòu)的獲得，可以把大部分生化數(shù)據(jù)連在一起，能夠很好地解釋過(guò)去的數(shù)據(jù)，也可以預(yù)測(cè)將來(lái)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)剪接體功能方面的研究也具有重要的推動(dòng)作用。

據(jù)清華大學(xué)官網(wǎng)，施一公本人表示“還要繼續(xù)推進(jìn)這一項(xiàng)基礎(chǔ)研究工作，并且下一步的工作重點(diǎn)是把不同剪接體相互間不同的地方看清楚，從而闡述內(nèi)含子被去除、外顯子被連接在一起的分子機(jī)制?！?/p>

成果從哪里來(lái)

2009年施一公帶領(lǐng)杭婧、萬(wàn)蕊雪博士和閆創(chuàng)業(yè)博士后進(jìn)入剪接體領(lǐng)域，開(kāi)始致力于剪接體及其相關(guān)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。他們?cè)?014年初首次報(bào)道了剪接體復(fù)合物中重要蛋白質(zhì)Lsm蛋白七聚體以及其RNA結(jié)合狀態(tài)下的晶體結(jié)構(gòu)。這一成果被《自然》雜志刊發(fā)后，課題組繼續(xù)聚焦于極富挑戰(zhàn)性的攻堅(jiān)戰(zhàn)——完整剪接體的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，終于在2015年5月份取得重大突破——捕獲了真核細(xì)胞剪接體復(fù)合物的高分辨率空間三維結(jié)構(gòu)。

剪接體是結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域公認(rèn)的難題，是細(xì)胞內(nèi)最后一個(gè)待解析結(jié)構(gòu)的超大復(fù)合體。一個(gè)年輕的團(tuán)隊(duì)在短短幾年實(shí)現(xiàn)重大突破，原因何在呢？應(yīng)該說(shuō)機(jī)會(huì)是留給有準(zhǔn)備的人的，這是多種因素共同作用的結(jié)果，下面介紹其中幾個(gè)比較重要的因素。

首先，技術(shù)突破給科研帶來(lái)創(chuàng)新機(jī)會(huì)。如果沒(méi)有冷凍電鏡技術(shù)的革新，就完全不可能得到剪接體近原子水平分辨率的結(jié)構(gòu)。一直以來(lái)，X射線晶體衍射、核磁共振方法和冷凍電鏡技術(shù)是研究生物大分子晶體結(jié)構(gòu)的主要方法。核磁共振方法只能解析小分子量的蛋白質(zhì)和核酸結(jié)構(gòu)。X射線晶體衍射的分辨率較高，但對(duì)樣品濃度要求較高，需要篩選合適的晶體生長(zhǎng)條件，形成晶體后方能分析其結(jié)構(gòu)。對(duì)于剪接體這樣動(dòng)態(tài)的、復(fù)雜的細(xì)胞機(jī)器，獲得其晶體幾乎是不可能的。冷凍電鏡技術(shù)逐漸發(fā)展成熟，將結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究對(duì)象由納米級(jí)擴(kuò)增至百納米甚至微米級(jí)，尤其是最近幾年冷凍電鏡技術(shù)取得革命性的突破，數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)和圖像處理技術(shù)都有了很大發(fā)展，冷凍電鏡的分辨率大大提高，已經(jīng)接近X射線晶體衍射的分辨率。2014年中國(guó)科學(xué)院生物物理所李國(guó)紅課題組解析出30 nm染色質(zhì)纖維左手雙螺旋結(jié)構(gòu)，也是利用冷凍電鏡技術(shù)做出的重要成果(李國(guó)紅研究員曾為我刊撰文《30 nm染色質(zhì)纖維高級(jí)結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展》介紹了該成果[4])。因此，冷凍電鏡技術(shù)的突破和清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)的建設(shè)為解析剪接體這一巨大、動(dòng)態(tài)、復(fù)雜的核酸蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。

其次，實(shí)驗(yàn)材料的正確選擇功不可沒(méi)。酵母易于培養(yǎng)和操作、增值快，便于大量表達(dá)目的蛋白，是分子和細(xì)胞生物學(xué)中最常用的實(shí)驗(yàn)材料，也是研究真核生物生命活動(dòng)的首選。劍橋大學(xué)Kiyoshi Nagai博士課題組解析的U4/U6.U5三聚snRNP三維結(jié)構(gòu)，所選用的實(shí)驗(yàn)材料是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，而施一公團(tuán)隊(duì)選用的是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。中國(guó)科學(xué)院植物生理與生態(tài)研究所徐永鎮(zhèn)研究員介紹說(shuō)：“雖然兩種酵母的基因數(shù)差別不大，但內(nèi)含子數(shù)目差異非常大，釀酒酵母的內(nèi)含子數(shù)為377個(gè)，粟酒裂殖酵母則含有約6 000個(gè)內(nèi)含子。更為重要的是，在釀酒酵母中，剪接是個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，U4/U6.U5三聚snRNP相對(duì)較多；而粟酒裂殖酵母因?yàn)榇嬖谀撤N突變，U2、U5和U6復(fù)合物天然地大量富集。施一公團(tuán)隊(duì)選擇粟酒裂殖酵母體現(xiàn)了其智慧，也是能獲得剪接體高分辨率三維結(jié)構(gòu)的重要因素。”

另外，年輕的團(tuán)隊(duì)為此課題付出了艱辛的努力。施一公團(tuán)隊(duì)掌握了極為成熟的樣品處理方法，能夠讓蛋白質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定，從而適宜在電鏡下觀察，這是該課題組能夠陸續(xù)取得科技成果的重要原因。比如，此次解析剪接體的三維結(jié)構(gòu)，萬(wàn)蕊雪和杭婧對(duì)樣品百般馴化，讓它們適合電鏡觀察；閆創(chuàng)業(yè)巧妙地革新了計(jì)算軟件，可以讓所有重要的顆粒都被再挑選出來(lái)。堅(jiān)持不懈的努力和細(xì)節(jié)處的創(chuàng)新同樣閃著光輝，值得學(xué)習(xí)。

致謝 感謝中國(guó)科學(xué)院植物生理與生態(tài)研究所徐永鎮(zhèn)研究員對(duì)本文的幫助。

(2015年11月20日收稿)

[1] YAN C Y, HANG J, WAN R X, et al. Structure of a yeast spliceosome at 3.6-angstrom resolution [J]. Science, 2015, 349(6253): 1182-1191.

[2] HANG J, WAN R X, YAN C Y, et al. Structural basis of pre-mRNA splicing [J]. Science, 2015, 349(6253): 1191-1198.

[3] WILL C L, LüHRMANN R. Spliceosome Structure and Function [J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2011, 3: a003707.

[4] 董立平, 陳萍, 李國(guó)紅. 30 nm染色質(zhì)纖維高級(jí)結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展 [J]. 自然雜志, 36(4): 274-279.

（編輯：沈美芳）

Structure of a yeast spliceosome at high resolution

DUAN Yanfang

10.3969/j.issn.0253-9608.2015.06.011

?通信作者，E-mail：yfduan@shu.edu.cn