劉曉琳

肝脾舒對(duì)肝硬化大鼠內(nèi)毒素血癥的影響

劉曉琳

目的 探討肝脾舒對(duì)肝硬化大鼠血漿內(nèi)毒素是否有調(diào)節(jié)作用。方法 雄性SD大鼠36只,隨機(jī)分為正常組、模型組、肝脾舒組、杜秘克組, 每組9只。正常組：每日腹腔注射生理鹽水, 模型組：采用40%CCl4橄欖油溶液腹腔注射制備肝硬化模型, 肝脾舒組在此基礎(chǔ)上每日給予肝脾舒灌胃, 杜秘克組在模型組基礎(chǔ)上每日給予杜秘克灌胃。取血檢測(cè)血漿內(nèi)毒素(LPS)水平。結(jié)果 3個(gè)月后模型組大鼠血漿內(nèi)毒素水平較正常組升高(P＜0.05)；與模型組相比, 肝脾舒組血清內(nèi)毒素水平降低(P＜0.05)。結(jié)論 肝脾舒對(duì)肝硬化大鼠血漿內(nèi)毒素水平有調(diào)節(jié)作用。

四氯化碳；肝硬化；肝脾舒；內(nèi)毒素

1 材料與方法

1.1 主要試劑

四氯化碳由成都科龍化工試劑廠生產(chǎn), 批號(hào)：150508。

內(nèi)毒素(lipopolysaccharide, LPS)試劑盒為南京建成科技有限公司的產(chǎn)品。

1.2 分組與處理

雄性SD大鼠, 36只, 清潔級(jí), 體重(200±20)g, 購(gòu)自中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 飼養(yǎng)在上海中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物在有恒溫、恒濕及晝夜光線變化的房間里飼養(yǎng), 自由進(jìn)食、進(jìn)水, 適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開始實(shí)驗(yàn)。

造模：本實(shí)驗(yàn)選用四氯化碳法造模 , 將大鼠按體重分?jǐn)?shù)予以40%CCl4溶液腹腔注射 , 0.3 ml/100 g體重, 首劑加倍,隔日1次, 造模90 d形成肝硬化模型。

分組：將36只大鼠隨即分為4組, 正常組、模型組、肝脾舒組、杜秘克組, 每組9只。

給藥：各組在造模同時(shí)給藥, 肝脾舒組20 ml/kg灌胃,正常組、模型組則用同等容量的生理鹽水灌胃, 杜秘克組按每日0.01mg/kg體重灌胃, 各組連續(xù)給藥90 d, 自由飲水, 普通飼料喂養(yǎng)。

檢測(cè)指標(biāo)：實(shí)驗(yàn)90 d后, 即用烏拉坦(1.25 g/kg)行腹腔麻醉, 取血檢測(cè)血漿中內(nèi)毒素水平, 取肝左葉于10%中性甲醛固定后行HE染色。

1.3 檢測(cè)方法 ①血清指標(biāo)檢測(cè) 檢測(cè)血漿中內(nèi)毒素水平 操作步驟按試劑盒說明書嚴(yán)格進(jìn)行 采用723 型分光光度計(jì)檢測(cè)②肝、回腸組織HE染色 經(jīng)甲醛固定后取肝組織及回腸組織石蠟包埋 切片脫蠟水化 常規(guī)HE染色后普通光鏡下觀察肝組織及回腸組織病理變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。多組間比較以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 ( x-±s)表示, 采用單因素方差分析, 兩兩比較方差齊時(shí)用LSD-t法, 方差不齊時(shí)用Dunnett'sT3 法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 與正常組相比, 模型組血漿內(nèi)毒素水平升高(P＜0.05),與模型組相比, 肝脾舒組血漿內(nèi)毒素水平降低(P＜0.05), 而杜秘克組血漿內(nèi)毒素水平與模型組相比, 雖有所降低, 但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。各組大鼠血漿內(nèi)毒素水平見表1。

表1 各組大鼠血漿中內(nèi)毒素水平( x-±s)

2.2 肝組織HE染色結(jié)果 正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整、清晰, 肝小葉正常, 肝細(xì)胞排列規(guī)則成索狀, 在中央靜脈周圍呈放射狀分布, 肝血竇結(jié)構(gòu)清晰, 無異常改變。肝細(xì)胞呈多邊形, 胞漿均勻, 細(xì)胞核形態(tài)正常；模型組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)松散、紊亂、有大量點(diǎn)狀壞死及灶狀壞死、肝索消失, 肝間質(zhì)廣泛纖維組織增生, 將正常肝小葉分割成大小不等的肝細(xì)胞團(tuán)(即假小葉形成)；肝脾舒組肝小葉結(jié)構(gòu)受損, 少數(shù)肝細(xì)胞氣泡樣變性但僅偶見壞死細(xì)胞, 少量纖維組織增生, 但未見形成間隔；杜秘克組肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞, 部分肝細(xì)胞氣泡樣變性并伴有細(xì)胞壞死, 纖維組織增生, 但較少形成間隔?；啬cHE染色顯示正常組大鼠腸絨毛排列整齊, 結(jié)構(gòu)完整, 長(zhǎng)短基本一致, 無絨毛倒伏、脫落現(xiàn)象。模型組大鼠腸絨毛縮短、表面長(zhǎng)短不一、結(jié)構(gòu)紊亂、大部分絨毛出現(xiàn)斷裂及壞死脫落、肌層增厚；肝脾舒組和杜秘克組腸絨毛局部變短、排列基本整齊、結(jié)構(gòu)尚完整, 部分絨毛有脫落、倒伏情況好轉(zhuǎn), 肌層增厚。

3 討論

肝硬化患者易發(fā)生全身各系統(tǒng)嚴(yán)重并發(fā)癥, 病死率高,臨床和實(shí)驗(yàn)研究均充分證實(shí)了腸屏障功能障礙在肝硬化并發(fā)癥的發(fā)展中所起的關(guān)鍵作用［1-3］。肝硬化患者常伴有腸源性內(nèi)毒素血癥( intestinal endotoxemia, IETM)［4］, 而腸黏膜屏障損傷是形成IETM的關(guān)鍵環(huán)節(jié), 腸道黏膜下固有層含有大量的肥大細(xì)胞, 其活化脫粒可釋放大量炎性介質(zhì)加重肝細(xì)胞損傷, 促進(jìn)肝硬化的發(fā)展［5］。肝硬化腸道功能異常導(dǎo)致腔內(nèi)細(xì)菌過度繁殖和內(nèi)毒素的產(chǎn)生, 后者可進(jìn)入體循環(huán)導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥, 內(nèi)毒素可激活白細(xì)胞產(chǎn)生和釋放炎癥介質(zhì), 如白細(xì)胞介素-1(IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IF-γ、一氧化氮(NO)諸如此類, 可引起循環(huán)衰竭和遠(yuǎn)端器官衰竭,造成腸道和肝臟損傷的進(jìn)一步加重, 并造成腸屏障功能-內(nèi)毒素血癥-臟器循環(huán)衰竭的惡性循環(huán)［6,7］。

作者在長(zhǎng)期的醫(yī)療實(shí)踐中, 充分把握肝臟生理病理特點(diǎn),認(rèn)為肝為將軍之官, 其病多實(shí)多熱, 脾為后天之本, 其病多虛多寒。結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病因?qū)W, 肝硬化的病因多為HBV、HCV等各種病毒侵襲人體, 羈留體內(nèi), 長(zhǎng)期不愈(HBV、HCV等屬中醫(yī)疫毒濕邪范疇)；或是長(zhǎng)期飲酒；或是長(zhǎng)期過食膏脂厚味等, 形成肝病多實(shí)證熱證的病理特點(diǎn)。王靈臺(tái)教授是全國(guó)有名的中西醫(yī)肝病專家, 作者曾有幸隨從臨證學(xué)習(xí), 深受其學(xué)術(shù)影響。王老在“病證并重辨證論治”的學(xué)術(shù)思想引導(dǎo)下,早年即以清肝為主立法, 組方“清肝顆粒”治療急慢性肝病,臨床及實(shí)驗(yàn)表明, 可顯著改善患者肝功能并抑制病毒復(fù)制［8］。肝與脾的關(guān)系, 是木與土的關(guān)系, 肝病實(shí), 易乘脾犯胃, 造成脾虛。所以古張仲景有“見肝之病, 知肝傳脾, 當(dāng)先實(shí)脾”的說法。脾虛的典型癥狀“納呆、腹脹、便溏”等亦是肝硬化患者的常見癥狀, 實(shí)際是和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)腸道的功能密切相關(guān)的。所以作者秉承王老的學(xué)術(shù)影響, 以清肝實(shí)脾立法, 組方肝脾舒(GPS), 藥物組成：虎杖、生白術(shù)、枳實(shí)、當(dāng)歸、廣郁金, 臨床靈活化裁, 隨證加減用于各型肝硬化患者, 均取得滿意療效, 不僅能緩解患者各種臨床癥狀, 改善各種生化免疫學(xué)指標(biāo), 還能有效防止肝性腦病、多臟器功能衰竭等并發(fā)癥的發(fā)生。還可以有效改善便秘患者腸道癥狀［9］, 真正起到“四季脾旺不受邪”的效果。而肝脾舒對(duì)肝硬化患者的腸道粘膜是否有保護(hù)作用其機(jī)制如何尚未可知, 本研究旨在從大鼠的腸道粘膜屏障這一角度入手, 探討肝脾舒對(duì)硬化肝的保護(hù)機(jī)制。

肝脾舒君藥虎杖, 主要有效成分為虎杖苷和白藜蘆醇和大黃素等。研究顯示, 虎杖提取物有抗內(nèi)毒素作用［10］；白藜蘆醇［11］在重癥急性胰腺炎的發(fā)生中具有抗氧化作用 , 能抑制TNF-α的產(chǎn)生 , 抑制ICAM-1和VCAM-1的表達(dá) , 大黃素可以促進(jìn)腸道平滑肌的蠕動(dòng)并能抗菌抗病毒, 從而發(fā)揮腸黏膜屏障的保護(hù)作用。由此, 對(duì)此方進(jìn)行進(jìn)一步的臨床和實(shí)驗(yàn)研究, 勢(shì)在必行, 也是一件利國(guó)利民的好事。

本研究模型組肝臟的病理變化表明其肝臟已經(jīng)形成了肝硬化。 模型組大鼠血漿內(nèi)毒素水平較正常組顯著升高,說明模型組形成了IETM。而肝脾舒組與杜秘克組肝臟的病理變化較模型組均有不同程度減輕, 血漿內(nèi)毒素水平也降低, 經(jīng)統(tǒng)計(jì), 肝脾舒組對(duì)血漿內(nèi)毒素水平的降低有作用明顯(P＜0.05), 而杜秘克組血漿內(nèi)毒素水平與模型組相比, 雖有所降低, 但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

肝臟受到損傷時(shí)肝臟Kupffer細(xì)胞功能減退, 腸道菌群失衡, 腸黏膜屏障損傷不能有效地阻止腸源性內(nèi)毒素進(jìn)入門靜脈, 腸道細(xì)菌及內(nèi)毒素易位形成IETM, 加重肝損傷。本研究模型組大鼠回腸組織病理改變表明其腸黏膜機(jī)械屏障受到損傷, 而肝脾舒組和杜秘克組回腸組織的病理變化較模型組均有不同程度減輕。說明肝脾舒和杜秘克均能夠有效保護(hù)腸黏膜屏障, 但在對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用和內(nèi)毒素血癥的改善方面, 肝脾舒組作用優(yōu)于杜秘克組。

綜上所述, 肝脾舒對(duì)肝硬化大鼠腸粘膜屏障具有保護(hù)作用,這可能是其減輕大鼠肝硬化程度、延緩肝硬化進(jìn)展的機(jī)制之一。

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2014-11-04］

200071 上海市中醫(yī)院消化科

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