江羅佳，楊麗萍，吳險峰，黃 翀，秦曉華，房向東，涂衛(wèi)平

0 引 言

腎間質(zhì)纖維化(Renal interstitial fibrosis，RIF)是各種原發(fā)性或繼發(fā)性病因?qū)е碌穆阅I病(chronic kidney disease，CKD)進展的共同病理途徑，最終依賴腎替代治療維持患者生命。迄今，臨床使用的治療方案雖可延緩RIF 的進展，但無法遏制甚至逆轉(zhuǎn)腎功能的喪失。多種細(xì)胞因子、生長因子、激素等均參與并協(xié)同完成腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)這個過程的演變。有學(xué)者利用信號通路特異性抑制劑證實RhoA/ROCK 信號通路在血管緊張素II 誘發(fā)的EMT 過程中參與重要角色［1］。近年來研究表明，機體的一些非造血組織亦表達人紅細(xì)胞生成素受體(erythropoietin receptor，EPOR)，如神經(jīng)元細(xì)胞、肺組織、睪丸間質(zhì)細(xì)胞及腎臟系膜細(xì)胞等。進一步的研究證實，促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)可對上述組織細(xì)胞發(fā)揮非血液學(xué)的生理作用。有學(xué)者認(rèn)為重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHuEPO)可能通過抑制神經(jīng)因子-κB p65 的激活，進而下調(diào)相關(guān)炎性因子的表達［2］，張華等［3］認(rèn)為外源性rHuEPO 的抗凋亡機制可能與肺組織內(nèi)蛋白激酶mRNA 相關(guān)，為尋求更好的證據(jù)表明EPO 的抗炎抗纖維化作用，本實驗通過體外模擬HK-2 清蛋白超負(fù)荷重吸收過程，同時使用rHuEPO進行藥物干預(yù)，觀察rHuEPO 對此環(huán)境下對RhoA/ROCK 信號通路的抗炎影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑 DMEM/F12 培養(yǎng)基(美國Hyclone)，胎牛血清(美國Gibco)，人純化清蛋白(成都雙流正龍研究所)，rHuEPO(沈陽三生制藥公司惠贈)，RNA 抽提試劑Trizol(美國Invitrogen)，RTPCR 試劑盒(美國Fermentas)，2 × EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，Rho 激酶抑制劑Y27632(美國Sigma)，纖維連接蛋白、白細(xì)胞介素-6(interIeukin-6，IL-6)定量酶聯(lián)檢測試劑盒(上海森雄生物技術(shù)公司)。

1.1.2 主要儀器 核酸微量蛋白測定儀、PCR 擴增儀(美國Bio-Rad)，Gel DocXR 凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司)，DYPC-31DN 型電泳儀(北京市六一儀器廠)，全自動酶標(biāo)儀(美國Thermo 公司)，熒光顯微鏡(日本Olym-pus)，5%CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma 公司)。

1.2 實驗步驟

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組 HK-2 細(xì)胞株來源于美國組織培養(yǎng)物細(xì)胞庫。取凍存于液氮中的HK-2細(xì)胞，立刻投入37 ℃溫水中解凍，離心半徑8 cm、1500 r/min 離心10 min，棄細(xì)胞上清液，加入10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基，吹打使得細(xì)胞沉淀混懸，接種于無菌培養(yǎng)瓶中，放置于37 ℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，2 d 換液1 次，當(dāng)鏡下觀察細(xì)胞融合至80%以上，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。按以下方法進行實驗分組:空白對照組(未加任何刺激物);rHuEPO 對照組(rHuEPO 終濃度為20 U/mL);清蛋白誘導(dǎo)組(清蛋白終濃度為5 mg/mL);5 U/mL rHuEPO 干預(yù)組［清蛋白(5 mg/mL)+rHuEPO(5 U/mL)］;10 U/mL rHuEPO 干預(yù)組［清蛋白(5 mg/mL)+rHuEPO(10 U/mL)］;20 U/mL rHuEPO 干 預(yù) 組［清 蛋 白(5 mg/mL)+rHuEPO(20 U/mL)］;Rho 激酶抑制組［加Y27632(10 μmol/L)30 min 后+清蛋白(5 mg/mL)］。1.2.2RT-PCR檢測 用Trizol 分別提取各組HK-2 細(xì)胞總的RNA，取總RNA 1.5 μg 進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，取cDNA 2μL 在2×EasyTaq PCR SuperMix 的作用下擴增目標(biāo)基因(以人β-actin 為內(nèi)參照)，總反應(yīng)體系50 μL。PCR 引物來源于美國Invitrogen 公司，設(shè)計如下:IL-6(180 bp):上游5'-AGGAGACTTGCCTGGTGAAA-3'，下 游 5'-CAGGGGTGGTTATTGCATCT-3';RhoA(356 bp):上游5'-GGCTGGACTCGGATTCGTTG-3'，下 游 5'-CGTTGGGACA GAAATGCTT GAC-3';ROCK1(293 bp):上游5'-TGATGGCTATTATGGACG AG-3'，下游5'-GGAGCGTTTCC CAAGC-3';β-actin(434 bp):上游5'-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，下游5'-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。擴增條件:94 ℃預(yù)變性2 ～5 min，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33 個循環(huán)，最后72 ℃終延伸2 min。最后配制2%瓊脂糖凝膠，PCR 擴增產(chǎn)物在120 V 電泳儀電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)成像并使用Quantity One 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 ELISA 法檢測纖維連接蛋白的表達 收集各組HK-2 細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按ELISA 試劑盒說明書進行操作，在酶標(biāo)儀上波長為450 nm 時的A 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別求出纖維連接蛋白、IL-6 蛋白表達濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，在方差齊性檢驗基礎(chǔ)上，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗法，若方差不齊則用秩和檢驗。以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 rHuEPO 對清蛋白誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變 正常HK-2 細(xì)胞或加入20 U/mL rHuEPO顯示鵝卵石或者鋪路石樣形態(tài)，給予清蛋白(5 mg/mL)刺激HK-2 細(xì)胞24 h 后表現(xiàn)出細(xì)長梭狀改變，呈現(xiàn)纖維細(xì)胞樣外觀。rHuEPO 在5、10、20 U/mL可呈濃度依賴性阻止清蛋白誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞纖維化，細(xì)胞向鵝卵石樣復(fù)轉(zhuǎn)。在Y27632 預(yù)處理30 min 后，再給予5 mg/mL 清蛋白誘導(dǎo)24 h，鏡下觀察可見細(xì)胞形態(tài)呈橢圓形、細(xì)胞間隙稍增大，但細(xì)胞改變的程度較清蛋白刺激組變小。見表1，圖1。

2.2 RT-PCR 結(jié)果 清蛋白刺激組RhoA、ROCK1 mRNA 及IL-6 mRNA 較空白對照組顯著升高(P ＜0.05)，5、10、20 U/mL rHuEPO 干預(yù)組RhoA、ROCK1 mRNA、IL-6 mRNA 逐漸下調(diào)(P ＜0.05)，且與rHuEPO濃度呈負(fù)相關(guān);Rho 激酶抑制組ROCK1 mRNA、IL-6 mRNA 與清蛋白刺激組相比亦顯著下調(diào)(P ＜0.05)，但RhoA mRNA 差異與清蛋白刺激組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。見表2。

2.3 ELISA 檢測上清液TNF-α、IL-6 蛋白含量空白對照組、rHuEPO 對照組HK-2 細(xì)胞分泌少量的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)、IL-6蛋白，與空白對照組比較，清蛋白刺激組誘導(dǎo)24 h后TNF-α、IL-6 蛋白呈現(xiàn)高水平的表達(P ＜0.05)，rHuEPO 濃度在5、10、20 U/mL 時TNF-α、IL-6 蛋清蛋白表達呈梯度性顯著下降，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，且Rho 激酶抑制組較清蛋白刺激組TNF-α、IL-6 蛋清蛋白濃度也有明顯下降(P ＜0.05)，見圖2，表2。

表1 HK-2 細(xì)胞IL-6 mRNA、RhoA 及ROCK1 mRNA 的相對表達水平，n=3)Table 1 Relative expression levels of IL-6 mRNA、RhoA and ROCK1 mRNA in HK-2 cells，n=3)

表1 HK-2 細(xì)胞IL-6 mRNA、RhoA 及ROCK1 mRNA 的相對表達水平，n=3)Table 1 Relative expression levels of IL-6 mRNA、RhoA and ROCK1 mRNA in HK-2 cells，n=3)

與空白對照組比較，* P ＜0.05;與清蛋白刺激組比較，#P ＜0.05;與5 U/mL rHuEPO 干預(yù)組比較，△P ＜0.05;與10 U/mL rHuEPO 干預(yù)組比較，▲P ＜0.05

組別IL-6 RhoA ROCK1空白對照組0.365±0.012 0.214±0.002 0.172±0.002 rHuEPO 對照組 0.359±0.023 0.210±0.002 0.172±0.003清蛋白刺激組 0.986±0.009 0.653±0.002* 0.780±0.002*5 U/mL rHuEPO 干預(yù)組 0.743±0.011*# 0.524±0.004*# 0.648±0.002*#10U/mL rHuEPO 干預(yù)組 0.584±0.026*#△ 0.407±0.003*#△ 0.522±0.004*#△20U/mL rHuEPO 干預(yù)組 0.437±0.003*#△▲0.262±0.005*#△▲ 0.285±0.002*#△▲Rho 激酶抑制組 0.628±0.002*# 0.591±0.001* 0.180±0.003#H 值 6.35 14.8 16 P 值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

圖1 顯微鏡下觀察HK-2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變(×100)Figure 1 Morphological changes of HK-2 cells under microscopy(×100)

圖2 HK-2 細(xì)胞RhoA、ROCK1 mRNA 及IL-6 mRNA 的表達情況Figure 2 The expressions of RhoA，ROCK1 mRNA and IL-6 mRNA in HK-2 cells

表2 HK-2 細(xì)胞的纖維連接蛋白、IL-6 蛋白表達水平，n=3)Table 2 The expression levels of FN，IL-6 protein in HK-2 cellsn=3)

表2 HK-2 細(xì)胞的纖維連接蛋白、IL-6 蛋白表達水平，n=3)Table 2 The expression levels of FN，IL-6 protein in HK-2 cellsn=3)

與空白對照組比較，* P ＜0.05;與清蛋白刺激組比較，#P ＜0.05;與5 U/mL rHuEPO 干預(yù)組比較，△P ＜0.05;與10 U/mL rHuEPO 干預(yù)組比較，▲P ＜0.05

組別 TNF-α(ng/L) IL-6(pg/L)空白對照組452.32±33.23 95.12±0.32 rHuEPO 對照組 448.53±43.23 94.99±0.20清蛋白刺激組 1347.54±41.52* 884.62±0.73*5 U/mL rHuEPO 干預(yù)組 1003.32±3.42*# 656.68±0.55*#10 U/mL rHuEPO 干預(yù)組 821.32±21.32*#△ 422.35±0.22*#△20 U/mL rHuEPO 干預(yù)組 590.15±7.68#△▲ 217.32±0.35*#△▲Rho 激酶抑制組 488.13±65.03#△▲ 309.49±0.21#△▲H 值 11.4 21.6 P 值 ＜0.05 ＜0.05

3 討 論

動物模型和人類腎疾病已證實腎間質(zhì)炎性因子浸潤的程度與臨床和病理病變程度相關(guān)，提示炎癥反應(yīng)在腎疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［4］。蛋白尿能通過啟動并加重釋放抑制因子，直接促進CKD的發(fā)生發(fā)展。蛋白尿尤其是腎病范圍的蛋白尿，能參與慢性腎間質(zhì)纖維化，其部分是通過介導(dǎo)HK-2的直接細(xì)胞毒性機制，使得腎小管逐步萎縮和疾病出現(xiàn)不可逆進展［5］。Tang 等［6］使用局灶節(jié)段性腎小球硬化患者的尿蛋白培養(yǎng)HK-2，發(fā)現(xiàn)HK-2 細(xì)胞E-鈣黏蛋白的表達下降，且伴隨α-平滑肌肌動蛋白、Ⅳ型膠原、纖維連結(jié)蛋白的表達增加，證明蛋白尿可導(dǎo)致EMT 的發(fā)生。蛋白尿可激活腎組織內(nèi)補體級聯(lián)反應(yīng)，隨后產(chǎn)生補體膜攻擊復(fù)合物以及包括C3a 在內(nèi)的活性產(chǎn)物，與腎組織中特異性受體相互結(jié)合，最終導(dǎo)致腎組織損害與腎功能下降。

IL-6 在感染、組織損傷及炎癥反應(yīng)等應(yīng)激原作用于機體數(shù)小時至數(shù)日內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生，合成如C 反應(yīng)蛋白、α1 抗胰蛋白酶、補體C3 等急性期蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖及生長，參與組織的纖維化過程。在高糖刺激的腎組織纖維化過程中，機體的血清及尿液中檢測TNF-α 均不同程度的升高［7］。TNF-α 能夠增加系膜細(xì)胞IL-6 mRNA 的轉(zhuǎn)錄過程，促使系膜細(xì)胞的增殖分裂，細(xì)胞外基質(zhì)增多［8-9］。目前研究表明，RhoA/ROCK 信號通路參與器官炎性過程，促進TNF-α，IL-6 等炎性基因及IL-6 基因的表達，而這些細(xì)胞因子在組織纖維化發(fā)生發(fā)展中起重要作用。TNF-α、IL-6 與RhoA/ROCK 之間引起細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的惡性循環(huán)，而TNF-α、IL-6 作為細(xì)胞外刺激因子，又可激活RhoA/ROCK，進一步放大炎癥反應(yīng)［10］。

據(jù)張林等［11］研究方法，本研究我們配制5 mg/mL清蛋白作為體外誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞超負(fù)荷濃度，以24 h作為HK-2 細(xì)胞超負(fù)荷誘導(dǎo)時間，結(jié)果顯示正常HK-2 細(xì)胞或加入20 U/mL rHuEPO 顯示鵝卵石或者鋪路石樣形態(tài)，給予清蛋白(5 mg/mL)刺激HK-2細(xì)胞24 h 后表現(xiàn)出細(xì)長梭狀改變，呈現(xiàn)纖維細(xì)胞樣外觀，而此時細(xì)胞內(nèi)IL-6 mRNA，細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α 蛋白表達均顯著增多，提示清蛋白能通過激活炎性反應(yīng)來誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞發(fā)生EMT。

研究認(rèn)為EPO 是有腎皮質(zhì)內(nèi)的間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生及分泌的，通常主要是小管周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞［12-13］。原位雜交大鼠在注射氯化鈷后，腎小管上皮細(xì)胞表明亦存在EPO mRNA 表達，揭示在病理條件下腎小管上皮細(xì)胞亦可合成EPO［14］。早在18 世紀(jì)人們就指出貧血與腎功能不全有著密切聯(lián)系，腎性貧血與小管間質(zhì)病變的程度相關(guān)，小管間質(zhì)損害越重，貧血就更顯著。Carnot 和Deflandre［15］于1906 年研究發(fā)現(xiàn)兔體內(nèi)骨髓紅系的生成受體內(nèi)激素調(diào)控，直到1950 年才證實其為紅細(xì)胞生成刺激因子，隨后命名EPO［16］。1957 年，Jacobson 等［17］研究證實EPO 主要產(chǎn)生與腎組織，后來Naets 和Hense 也相繼進行深入研究，逐步證實了腎性貧血主要是由于病理狀態(tài)下機體EPO 缺乏，展開了對腎功能不全患者的繼發(fā)性貧血認(rèn)識的新篇章。近年來，隨著對EPO 及其受體作用機制的不斷探討，EPO 的臨床應(yīng)用領(lǐng)域也逐步擴展，不僅局限在腎性貧血的治療中，并且對其他病因?qū)е碌呢氀?、骨髓增生性疾病、營養(yǎng)不良、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腦血管病變以及創(chuàng)傷等均具備一定療效。因此，EPO 被認(rèn)為是一種具備多種生物學(xué)效應(yīng)的保護性細(xì)胞因子，人們更欲于挖掘其糾正貧血之外的護腎作用機制。EPO 可延緩RIF 進展，其機制可能涉及抑制ECM 過程、遏制腎固有細(xì)胞凋亡、對抗氧化應(yīng)激以及腎素-血管緊張素等［18-20］。有學(xué)者則利用體內(nèi)外實驗證實EPO 可減輕TGF-β1 誘導(dǎo)的ECM 過程，主要表現(xiàn)為EPO 能夠減少α-平滑肌肌動蛋白表達，減輕E-鈣黏蛋白蛋白的丟失［21］。1958 年Jacobs 等［22］和Kimel 等［23］首次通過基因工程技術(shù)合成rHuEPO，20世紀(jì)90 年代后才開始應(yīng)用于臨床，即使用rHuEPO治療各種慢性腎功能衰竭患者的并發(fā)癥。此后多年中，臨床上對rHuEPO 的應(yīng)用領(lǐng)域始終局限于免疫功能缺陷患者的貧血癥狀的改善。rHuEPO 其生物學(xué)活性、免疫學(xué)特性與天然內(nèi)源性EPO 相似［24］，臨床療效亦與EPO 相同，具備多種藥理學(xué)作用。本實驗結(jié)果提示，重組人EPO 在5、10、20 U/mL 可以呈濃度依賴性阻止清蛋白誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞纖維化，細(xì)胞向鵝卵石樣復(fù)轉(zhuǎn)。5 U/mL rHuEPO 干預(yù)組、10 U/mL rHuEPO 干預(yù)組、20 U/mL rHuEPO 干預(yù)組中重組人EPO 能呈濃度梯度依賴性降低IL-6 mRNA 以及TNF-α、IL-6 蛋白表達，同時RhoA、ROCK1 mRNA亦逐步降低，以上與E3 相比有顯著性差異，表明rHuEPO 對炎癥過程有顯著抑制作用，同時能夠阻止RhoA/Rock 信號通路激活。因此，我們推測，rHuEPO 可能通過抑制炎癥因子產(chǎn)生來干預(yù)清蛋白超負(fù)荷引起的EMT 過程，從而達到延緩腎間質(zhì)纖維化進展的目的，其作用過程可能與遏制RhoA/ROCK 信號通路激活密切相關(guān)。

總之，TNF-α、IL-6 因子在CKD 患者機體內(nèi)微炎癥反應(yīng)中扮演十分重要角色［25］。當(dāng)前，RhoA/ROCK 信號通路在EMT 的發(fā)生、發(fā)展過程中受到廣泛關(guān)注。RhoA/ROCK 信號通路的進一步深入探討有望成為防治腎間質(zhì)纖維化提供一個新的治療方案。本實驗表明，重組人EPO 對腎纖維化細(xì)胞的保護作用與抑制TNF-α、IL-6 等促炎因子表達相一致，而其護腎作用與干預(yù)RhoA/Rock 信號通路傳導(dǎo)亦可能關(guān)聯(lián)，說明rHuEPO 對清蛋白誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞的抗炎反應(yīng)與抑制RhoA/Rock 信號通路傳導(dǎo)有密切關(guān)系。

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