鄭敬民，尹 廣，惲?xí)r鋒，趙文緊

0 引 言

補(bǔ)體系統(tǒng)的不適當(dāng)激活也會(huì)導(dǎo)致組織的損傷。越來(lái)越多的研究表明，補(bǔ)體系統(tǒng)參與了多種人類疾病的發(fā)生、發(fā)展過程［1-4］。補(bǔ)體活化與包括糖尿病腎病在內(nèi)的多種病變相關(guān)［5-7］。但有關(guān)補(bǔ)體系統(tǒng)參與糖尿病腎病等腎組織損傷的機(jī)制仍未明了。膜攻擊復(fù)合物的形成是各種補(bǔ)體活化通路的最終結(jié)果。通過形成膜攻擊復(fù)合物，活化的補(bǔ)體系統(tǒng)可導(dǎo)致組織細(xì)胞的破壞損傷。但除了最終的膜攻擊復(fù)合物，在各種途徑的補(bǔ)體活化過程中，還產(chǎn)生了一系列被稱作過敏毒素的補(bǔ)體成分小片段(包括C3a、C4a 和C5a，分別由C3、C4 和C5 裂解產(chǎn)生)，它們也可能參與糖尿病腎病等腎組織損傷過程。但目前對(duì)于各種過敏毒素在腎組織損傷中的確切病理作用和意義仍不清楚。為了探討過敏毒素在腎組織損傷中的可能作用，本文設(shè)計(jì)構(gòu)建了最為重要的過敏毒素——C3a的分泌性表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入到HK2 人腎小管上皮細(xì)胞構(gòu)建了分泌性高表達(dá)C3a 的人腎小管上皮細(xì)胞株HK2-C3a，為探討C3a 在腎小管上皮細(xì)胞中的生理功能和病理意義提供了很好的細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 C3a 分泌性表達(dá)載體的構(gòu)建及重組慢病毒包裝和制備 基本過程如下:根據(jù)人C3 mRNA 序列和人IL-6 mRNA 序列，設(shè)計(jì)合成C3a 分泌表達(dá)重組基因(即IL-6 信號(hào)肽編碼序列(NM_000600.3 中的117-203 部分)+C3a 編碼序列(NM_000064.2 中的2076-2306 部分)。將其克隆到慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP 的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成C3a 慢病毒分泌性表達(dá)載體pLenti6.3-C3a-IRES2-EGFP，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后，用構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-C3a-IRES2-EGFP 和包裝質(zhì)粒(packaging mix)共轉(zhuǎn)染293 T 細(xì)胞，包裝成C3a 表達(dá)重組慢病毒。收集病毒原液，超速離心濃縮，并測(cè)定滴度，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。C3a 分泌性表達(dá)載體的構(gòu)建和慢病毒包裝由Invitrogen 公司提供服務(wù)。

1.2 人腎小管上皮細(xì)胞系HK2 的來(lái)源和培養(yǎng)HK2 人腎小管上皮細(xì)胞由美國(guó)ATCC 引進(jìn)，現(xiàn)保存于我們實(shí)驗(yàn)室。HK2 細(xì)胞以含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基于37 ℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞每3 天換液1 次，長(zhǎng)至約80%以1∶4 進(jìn)行傳代。

1.3 基因轉(zhuǎn)染、藥物篩選和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單克隆細(xì)胞株的構(gòu)建 轉(zhuǎn)染前1 d，將HK2 細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于24 孔板。經(jīng)37 ℃，5% CO2孵箱培養(yǎng)24 h 后，將含C3a 表達(dá)重組慢病毒的溶液冰上融解，按MOI 值為5 的比例用培養(yǎng)液稀釋病毒，并加入終濃度為8 μg/mL 的Polybrene，輕輕混勻后加入到細(xì)胞中。培養(yǎng)箱中孵育6 h 后，換上新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)置孵箱培養(yǎng)。24 h 后將細(xì)胞置熒光顯微鏡下觀察，根據(jù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞能發(fā)出綠色熒光的特點(diǎn)判斷轉(zhuǎn)染是否成功。轉(zhuǎn)染48 h 后，消化細(xì)胞，以1∶6 的比例重新接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并加10 μg/mL 的殺稻瘟菌素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，持續(xù)篩選14 d，期間每3 天換液1 次。此后，以稀釋法篩選C3a 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單細(xì)胞克隆，構(gòu)建成C3a 分泌性表達(dá)HK2 細(xì)胞株。

1.4 細(xì)胞總RNA 的提取和cDNA 合成 細(xì)胞總RNA 的提取采用TRIZOL 試劑(Invitrogen 公司產(chǎn)品)，cDNA 合成采用Tarkara 公司的“PrimeScript RT Master Mix(Perfect real time)”逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，具體操作按試劑盒說明進(jìn)行。

1.5 C3a mRNA 表達(dá)的熒光定量PCR 分析 分別根據(jù)重組分泌性表達(dá)C3a 基因序列(見1.1 部分)和18S RNA 序列(Homo sapiens RNA，18S ribosomal 5(RNA18S5)，ribosomal RNA，NR_003286.2)，利用DNASIS v2.5 Demo 軟件設(shè)計(jì)C3a 引物和18S RNA 引物，由金唯智生物科技有限公司合成引物。引物序列分別為:人C3a sense:5'-aag tcg gca agt acc cca ag-3';人C3a antisense:5'-agt tgc agc agt cca gga ag-3';人18S RNA sense:5'-ttt ctc gat tcc gtg ggt gg-3';人18S RNA antisense:5'-agc atg cca gag tct cgt tc-3'。熒光定量PCR 分析采用Tarkara 公司的“SYBR Premix Ex Taq II Tli RNaseH Plus”試劑盒，以18S RNA 為內(nèi)參于ABI 公司的7900 型熒光定量PCR 儀上進(jìn)行。PCR 擴(kuò)增條件是95 ℃1 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.6 C3a 表達(dá)水平的檢測(cè)方法 根據(jù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌性表達(dá)C3a 的特點(diǎn)，利用人C3a ELISA 試劑盒(Human C3a ELISA Kit，BD 公司，Cat.No.55049)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中C3a 的濃度，了解轉(zhuǎn)染細(xì)胞C3a 分泌性表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 10.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)的比較視方差齊性檢驗(yàn)(以0.1 作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行Levene 檢驗(yàn))結(jié)果，方差齊時(shí)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Satterthwaite 校正t 檢驗(yàn)，以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 C3a 分泌性表達(dá)慢病毒表達(dá)載體的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和鑒定 C3a 分泌性表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建過程見圖1。對(duì)于構(gòu)建成的C3a 慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-C3a-IRES2-EGFP，進(jìn)行了全序列測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示所構(gòu)建的表達(dá)載體的序列完全正確，說明C3a 慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功，部分測(cè)序結(jié)果見圖2。

圖1 C3a 分泌性表達(dá)慢病毒載體pLenti6.3-C3a-IRES2-EGFP 的構(gòu)建過程示意圖Figure 1 The construction process of C3a secretory expression vector pLenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP

圖2 C3a 分泌性表達(dá)慢病毒載體pLenti6.3-C3a-IRES2-EGFP 的部分測(cè)序結(jié)果Figure 2 Sequencing result of C3a secretory expression vector pLenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP

2.2 C3a 過表達(dá)慢病毒的包裝 以構(gòu)建的C3a 慢病毒表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒(pLP1、pLP2 和pLP/VSVG)共轉(zhuǎn)染293 T 細(xì)胞，48 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，經(jīng)分級(jí)離心和滴度測(cè)定，最后得到了滴度約為5×108個(gè)/mL 的慢病毒液。見圖3。

圖3 鏡下觀察C3a 重組慢病毒液感染的HEK 293 細(xì)胞Figure 3 Observation of HEK293 cells infected by C3a recombinant lentivirus under microscopy

2.3 HK2 細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選 將C3a 重組慢病毒轉(zhuǎn)染HK2 人腎小管上皮細(xì)胞，24 h 后，熒光顯微鏡下即可觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，至轉(zhuǎn)染后48 h 轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光蛋白表達(dá)更強(qiáng)。為了獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，我們將細(xì)胞消化重新輔板，同時(shí)根據(jù)C3a 慢病毒表達(dá)載體中帶有殺稻瘟菌素抗性基因的特點(diǎn)，于細(xì)胞培養(yǎng)基中加入殺稻瘟菌素以殺死除穩(wěn)定轉(zhuǎn)染以外的其他細(xì)胞。經(jīng)過2 周的連續(xù)加藥篩選，得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染C3a 重組慢病毒的細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上，利用連續(xù)稀釋方法，進(jìn)一步篩選出了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染C3aR 重組慢病毒的細(xì)胞克隆，進(jìn)而構(gòu)建成了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株HK2-C3a，見圖4。

2.4 HK2-C3a 細(xì)胞株中C3a 的表達(dá)分析結(jié)果 利用熒光定量PCR 方法對(duì)HK2-C3a 細(xì)胞株中C3a mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析，與作為對(duì)照的正常(非轉(zhuǎn)染)HK2 細(xì)胞相比，HK2-C3a 細(xì)胞株中C3a mRNA 表達(dá)水平顯著升高［(1.0±0.5)vs(1 321.0±181.0)］?；贓LISA 檢測(cè)的結(jié)果顯示，HK2-C3a 細(xì)胞培養(yǎng)上清中C3a 的水平比HK2 細(xì)胞培養(yǎng)上清中顯著升高［(0.3±0.2)ng/mL vs(249.0±37.0)ng/mL］。

圖4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染C3a 重組慢病毒的HK2 細(xì)胞株的構(gòu)建結(jié)果Figure 4 Construction of HK2 cell strain stably transfected by C3a recombinant lentivirus

3 討 論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，補(bǔ)體系統(tǒng)不僅是人類防御系統(tǒng)的重要組成部分，而且還是人類多種疾病的重要致病因素。有關(guān)補(bǔ)體系統(tǒng)的不當(dāng)激活在人類疾病中的作用已引起了不少研究者的關(guān)注，成為了多種人類疾病機(jī)制研究的一個(gè)重要新熱點(diǎn)［1-4，8］。雖然人們?cè)缇驼J(rèn)識(shí)到包括糖尿病腎病、膜性腎病和狼瘡性腎炎在內(nèi)的多種腎臟疾病患者腎組織中均存在補(bǔ)體過度活化現(xiàn)象，但對(duì)于補(bǔ)體系統(tǒng)在腎組織損傷中的確切作用和參與腎組織損傷的確切分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)卻仍然很有限。

理論上，補(bǔ)體的過度活化可以多種方法參與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程。但長(zhǎng)期以來(lái)，人們對(duì)補(bǔ)體活化致組織損傷作用的關(guān)注更多的是集中于膜攻擊復(fù)合物的效應(yīng)。但在補(bǔ)體的鏈?zhǔn)郊せ钸^程中，同時(shí)產(chǎn)生了包括C3a 在內(nèi)的一系列小片段分子，它們被釋放到周圍微環(huán)境中，參與了對(duì)機(jī)體細(xì)胞功能的各種調(diào)節(jié)。作為一種重要的促炎因子，C3a 可通過與其受體C3aR 的作用趨化和激活白細(xì)胞，促進(jìn)白細(xì)胞脫顆粒和分泌各種炎癥因子［9-12］。而近年來(lái)的研究表明［8］，除了廣泛表達(dá)于各種免疫細(xì)胞外，C3aR 還表達(dá)于包括腦、肝、肺、腎在內(nèi)的多種器官中的組織細(xì)胞，且在不同的組織細(xì)胞和不同生理病理情景中表現(xiàn)出多種多樣的重要功能。在腎中，C3aR主要表達(dá)于上皮細(xì)胞(包括腎小管上皮細(xì)胞、腎小球足細(xì)胞和壁層上皮細(xì)胞)［13-14］，但目前對(duì)于C3aR的生理功能和各種病理情景下的病理意義仍不清楚。考慮到多種腎病患者腎組織中存在的補(bǔ)體過度活化現(xiàn)象(意味著有大量的C3a 會(huì)被釋放出來(lái)并可能激活腎組織細(xì)胞中的受體C3aR)、C3a/C3aR 軸過度活化在一些組織細(xì)胞中所表現(xiàn)出來(lái)的包括影響細(xì)胞發(fā)育分化、細(xì)胞增殖或凋亡等在內(nèi)的重要功能［15-20］、以及腎小管損傷在糖尿病腎病等腎疾病中的重要性，我們推測(cè):C3a/C3aR 軸過度活化很可能在腎小管上皮細(xì)胞損傷中有重要作用。為探討C3a/C3aR 軸過度活化在腎小管上皮細(xì)胞損傷中的病理意義，本研究構(gòu)建了分泌性過表達(dá)C3a 人腎小腎小管上皮細(xì)胞株。我們首先設(shè)計(jì)合成了C3a 分泌性表達(dá)單元，并成功地將其克隆到了慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-IRES2-EGFP 的多克隆位點(diǎn)，經(jīng)全序列測(cè)序驗(yàn)證，得到序列完全正確的慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-C3a-IRES2-EGFP。在此基礎(chǔ)上，利用293 T 細(xì)胞進(jìn)行了重組慢病毒的包裝，并得到了高滴度的C3a 重組慢病毒。利用C3a 重組慢病毒，對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞系HK2 進(jìn)行了轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，經(jīng)藥物篩選和稀釋法克隆得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了C3a 重組慢病毒的HK2 細(xì)胞株HK2-C3a。進(jìn)而利用熒光定量PCR和ELISA 方法對(duì)HK2-C3a 細(xì)胞株C3a 的表達(dá)和分泌情況進(jìn)行了分析，結(jié)果證實(shí)C3a 在HK2-C3a 細(xì)胞株中的分泌性高水平表達(dá)，成功構(gòu)建了分泌性過表達(dá)C3a 的人腎小管上皮細(xì)胞株。特別是在表達(dá)載體的設(shè)計(jì)構(gòu)建過程中，我們充分考慮到了過敏毒素C3a 基因的特殊情況。由于C3a 只是補(bǔ)體C3 的一個(gè)片段，在人和各種動(dòng)物的基因組中并不存在單獨(dú)的C3a 基因(只有C3 基因)。如果我們直接克隆天然的C3 基因用于構(gòu)建表達(dá)載體，則要增加C3a 的水平還需想辦法激活補(bǔ)體C3 而使其裂解，這樣不僅比較麻煩，而且同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生其他補(bǔ)體活化產(chǎn)物(比如C3b)而使問題復(fù)雜化，不利于下游進(jìn)一步的對(duì)C3a 在腎組織細(xì)胞中作用的研究。因此本研究根據(jù)C3a 編碼序列進(jìn)行了C3a 表達(dá)單元的人工合成來(lái)避免上述問題，其優(yōu)點(diǎn)顯而異見。而為了使表達(dá)合成的C3a 能高水平地分泌到細(xì)胞外C3a 主要通過與其受體C3aR(位于細(xì)胞膜上)的結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)功能，又特別在C3a 編碼序列的上游增加了IL-6 基因的信號(hào)肽序列。從對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)來(lái)看，成功實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)染后C3a 的高水平分泌性表達(dá)。

C3a 分泌性表達(dá)載體的成功構(gòu)建對(duì)于進(jìn)一步探討C3a/C3aR 軸在相關(guān)細(xì)胞中的正常生理和特定病理情況下的病理意義和相關(guān)分子機(jī)制極為有用。就HK2-C3a 細(xì)胞株來(lái)說，可通過比較HK2-C3a 細(xì)胞與正常HK2 細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上的差異了解C3a/C3aR 軸在人腎小管上皮細(xì)胞中的生理功能;通過比較HK2-C3a 細(xì)胞與正常HK2 細(xì)胞基因表達(dá)譜和相關(guān)信號(hào)通路水平的差異，了解C3a/C3aR 軸作用的分子機(jī)制;通過分析高糖、氧化應(yīng)激、炎癥等因素對(duì)HK2-C3a 細(xì)胞與正常HK2 細(xì)胞影響的差異，探討上述特定病理?xiàng)l件下C3a/C3aR 軸的病理意義和分子機(jī)制。當(dāng)然，也可利用本研究構(gòu)建的C3a 慢病毒轉(zhuǎn)染足細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞，以及其他各種細(xì)胞，觀察分析C3a/C3aR 軸在這些細(xì)胞中的生理和特定病理?xiàng)l件下的意義?？傊芯坎粌H為進(jìn)一步研究各種病理情況下C3a/C3aR 過度活化在人腎小管損傷中的作用和意義，探討活化補(bǔ)體通過激活C3aR 致腎小管上皮細(xì)胞損傷的作用和分子機(jī)制提供了很好的細(xì)胞模型，所構(gòu)建的重組C3a 慢病毒也為進(jìn)一步開展C3a 對(duì)其它細(xì)胞的作用和病理意義創(chuàng)造了條件。本文構(gòu)建的表達(dá)載體和細(xì)胞株也有不足之處，即轉(zhuǎn)基因C3a 是以組成型方式表達(dá)，如能以可誘導(dǎo)型方式對(duì)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平進(jìn)行很好的調(diào)控，則對(duì)于更精細(xì)地研究C3a/C3aR 軸功能更為有利。

［1］ Lappega°rd KT，Garred P，Jonasson L，et al.A vital role for complement in heart disease［J］.Mol Immunol，2014，61(2):126-134.

［2］ Schramm EC，Clark SJ，Triebwasser MP，et al.Genetic variants in the complement system predisposing to age-related macular degeneration:a review［J］.Mol Immunol，2014，61(2):118-125.

［3］ Peterson SL，Anderson AJ.Complement and spinal cord injury:traditional and non-traditional aspects of complement cascade function in the injured spinal cord microenvironment［J］.Exp Neurol，2014，258:35-47.

［4］ Hertle E，Stehouwer CD，van Greevenbroek MM.The complement system in human cardiometabolic disease［J］.Mol Immunol，2014，61(2):135-148.

［5］ Fearn A，Sheerin NS.Complement activation in progressive renal disease［J］.World J Nephrol，2015，4(1):31-40.

［6］ Thurman JM.Complement in kidney disease:core curriculum 2015［J］.Am J Kidney Dis，2015，65(1):156-168.

［7］ 鄭敬民，尹 廣，姚根宏，等.腎病患者腎組織補(bǔ)體活化與肥大細(xì)胞滑潤(rùn)的關(guān)系研究［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2012，25(10):1040-1044.

［8］ Klos A，Wende E，Wareham KJ，et al.International Union of Basic and Clinical Pharmacology.［corrected］.LXXXVII.Complement peptide C5a，C4a，and C3a receptors［J］.Pharmacol Rev，2013，65(1):500-543.

［9］ Mueller-Ortiz SL，Morales JE，Wetsel RA.The Receptor for the Complement C3a Anaphylatoxin(C3aR)Provides Host Protection against Listeria monocytogenes-Induced Apoptosis［J］.J Immunol，2014，193(3):1278-1289.

［10］ Niebuhr M，B?umer W，Kietzmann M，et al.Participation of complement 3a receptor(C3aR)in the sensitization phase of Th2 mediated allergic contact dermatitis［J］.Exp Dermatol，2012，21(1):52-56.

［11］ Bao L，Wang Y，Haas M，et al.Distinct roles for C3a and C5a in complement-induced tubulointerstitial injury［J］.Kidney Int，2011，80(5):524-534.

［12］ Zhou W.The new face of anaphylatoxins in immune regulation［J］.Immunobiology，2012，217(2):225-234.

［13］ Braun MC，Reins RY，Li TB，et al.Renal expression of the C3a receptor and functional responses of primary human proximal tubular epithelial cells［J］.J Immunol，2004，173(6):4190-4196.

［14］ 鄭敬民，朱小東，張明超，等.過敏毒素受體(C3aR)在db/db 糖尿病腎病小鼠腎臟中的表達(dá)及病理意義分析［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2010，37(8):847-854.

［15］ 胡金川，田亞平，江朝光，等.紅細(xì)胞補(bǔ)體受體1 分子水平及其基因單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)聯(lián)研究［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26(7):729-733.

［16］ Carmona-Fontaine C，Theveneau E，Tzekou A，et al.Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration［J］.Dev Cell，2011，21(6):1026-1037.

［17］ Yu M，Zou W，Peachey NS，et al.A novel role of complement in retinal degeneration［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2012，53(12):7684-7692.

［18］ Tu Z，Bu H，Dennis JE，et al.Efficient osteoclast differentiation requires local complement activation［J］.Blood，2010，116(22):4456-4463.

［19］ Lim J，Iyer A，Suen JY，et al.C5aR and C3aR antagonists each inhibit diet-induced obesity，metabolic dysfunction，and adipocyte and macrophage signaling［J］.FASEB J，2013，27(2):822-831.

［20］ Xu XH，Peng HS，Sun MQ，et al.C-terminal peptide of anaphylatoxin C3a enhances hepatic function after steatotic liver transplantation:a study in a rat model［J］.Transplant Proc，2010，42(3):737-740.