韋武亭，王漢東，吳 永，丁 惠，丁 可，李 桃

0 引 言

創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病，具有較高的發(fā)生率、致殘率、病死率［1-2］。雖然近年來關(guān)于TBI 的研究都取得較大的進(jìn)展，但關(guān)于TBI 的神經(jīng)保護(hù)藥物的研究尚未取得突破性進(jìn)展。α-硫辛酸在自然界廣泛分布，屬于B 族維生素化合物，是一種天然的強(qiáng)抗氧化劑［3］。硫辛酸是線粒體內(nèi)丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶的關(guān)鍵輔基，能夠改善和促進(jìn)氧化磷酸化和提高線粒體的功能，能夠清除自由基，螯合金屬離子，再生內(nèi)源性抗氧化劑，減少細(xì)胞的凋亡［4-5］。本研究通過小鼠TBI 模型探討α-硫辛酸是否對(duì)線粒體具有保護(hù)作用，從而減少腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，也為今后TBI 的研究和臨床治療提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康雄性ICR 小鼠，6 周齡，72 只，28 ～30 g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SCXK(軍)2012-0014。將小鼠置于安靜、溫暖舒適的環(huán)境中(溫度:25 ℃，濕度:50%)，自由飲食飲水。α-硫辛酸購自于美國(guó)Sigma公司，尼氏染色液購于碧云天生物技術(shù)有限公司，TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)羅氏(Roche)公司，細(xì)胞色素c(Cytochrome c)和Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bcl-2 Associated X Protein，Bax)抗體購自美國(guó)Abcan 公司。COX IV 抗體和Caspase-3 抗體購自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 α-硫辛酸溶于溶劑(含二甲基亞砜的玉米油)中，72 只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4 組:假手術(shù)+溶劑組，假手術(shù)+α-硫辛酸組，外傷+溶劑組，外傷+α-硫辛酸組，每組18只。假手術(shù)+α-硫辛酸組與外傷+α-硫辛酸組給予α-硫辛酸(100 mg/kg)，假手術(shù)+溶劑組和外傷+溶劑組在同一時(shí)間給予相等劑量的溶劑。所有小鼠于模型制作后30 min 灌胃給藥，24 h 后重復(fù)給1 次，48 h后取標(biāo)本。

1.3 TBI 模型 小鼠苯巴比妥(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于立體定向儀上，采用自由落體法制備閉合性小鼠腦損傷模型［6］:備皮消毒后將小鼠頭皮沿中線位置切開約1 cm，撞擊點(diǎn)定位于冠狀縫后3 mm 和矢狀縫左側(cè)3 mm 的交叉點(diǎn)。假手術(shù)組僅切開頭皮，外傷組使用200 g 重物自2.5 cm 高處自由落體垂直撞擊于定位點(diǎn)上。

1.4 腦水腫檢測(cè) TBI 后48 h，經(jīng)左側(cè)心室灌注40 mL 等滲鹽水(4 ℃)后迅速斷頭取腦，去除腦干和小腦后，即可獲得左側(cè)皮層組織。每個(gè)樣品立即測(cè)定濕重，然后在80 ℃烘箱中放置72 h，獲得干重。公式如下:

腦含水量=［(濕重-干重)/濕重］×100%［7］

1.5 Western blot 檢測(cè) 致傷48 h 后，經(jīng)左側(cè)心室灌注40 mL 等滲鹽水(4 ℃)后迅速斷頭取腦，取傷灶周圍3 mm 范圍腦組織。根據(jù)組織線粒體分離試劑盒(#c3606;上海碧云天生物技術(shù)有限公司)說明書提取。將新鮮的組織樣品在冰浴上進(jìn)行勻漿，在1000×g，4 ℃離心5 min。取上清在3500×g，4 ℃離心10 min，所得沉淀即為分離所得的線粒體，此次上清液在12 000×g，4 ℃離心10 min，取上清液即為去除線粒體的細(xì)胞質(zhì)蛋白。

用10%的SDS-PAGE 膠，恒壓110 V 電泳分離所提取的蛋白，使用恒流200 mA 50 min 將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，將帶有目標(biāo)蛋白的膜裁好并加入5%脫脂牛奶封閉1 h，然后根據(jù)抗體說明書孵育一抗和內(nèi)參過夜，第2 天用TBST 漂洗10 min×3 次，用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗孵育2 h，再用TBST漂洗10 min×3 次，接著在暗房中發(fā)光液顯影后用X射線膠片(Fuji Hyperfilm，Tokyo，Japan)曝光。蛋白水平用UN-SCAN-IT 軟件(Silk Scientific Inc.，Orem，UT，USA)處理分析。

1.6 免疫組化染色 通過免疫組化評(píng)估Caspase-3的表達(dá)。腦組織標(biāo)本均經(jīng)福爾馬林固定24 h 后，石蠟包埋。切片厚度為5μm，常規(guī)脫蠟、脫水，用枸櫞酸緩沖液修復(fù)抗原，正常山羊血清封閉1 h，然后孵育兔單克隆Caspase-3 抗體，濃度為1∶300，4 ℃過夜，第2 天用PBS 漂洗10 min×3 次后，用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育1 h，濃度為1∶500。再用PBS 漂洗10 min×3 次，用蘇木精、二氨基聯(lián)苯胺顯色，封固。在光學(xué)顯微鏡下觀察傷灶皮層周圍區(qū)域染色結(jié)果，在400 倍鏡隨機(jī)選取6 個(gè)視野對(duì)Caspase-3陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以平均100 個(gè)細(xì)胞中Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)作為陽性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 尼氏染色 腦組織切片厚度為5 μm，染色操作過程按尼氏染色液說明書進(jìn)行。在光學(xué)顯微鏡下觀察傷灶皮層周圍區(qū)染色結(jié)果，在400 倍鏡下隨機(jī)選取6 個(gè)視野對(duì)存活的神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以平均100個(gè)細(xì)胞中神經(jīng)元細(xì)胞存活數(shù)作為神經(jīng)元存活率。

1.8 TUNEL 染色 腦組織切片厚度為5 μm，染色操作過程按TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。在光學(xué)顯微鏡下觀察傷灶皮層周圍區(qū)染色結(jié)果，在400 倍鏡下隨機(jī)選取6 個(gè)視野對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以平均100 個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)作為凋亡指數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

假手術(shù)組中均無小鼠死亡，外傷+溶劑組小鼠死亡3 只，外傷+硫辛酸組小鼠死亡1 只。

2.1 α-硫辛酸對(duì)小鼠外傷后腦水腫的影響 外傷+溶劑組腦組織含水量［(81.71±0.66)%］高于外傷+α-硫辛酸組［(79.89±0.55)%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01);亦高于假手術(shù)+溶劑組［(79.05±0.67)%］、假 手 術(shù) + α-硫 辛 酸 組［(78.65±0.37)%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。而假手術(shù)+溶劑組與假手術(shù)+α-硫辛酸組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ﹥0.05)。

2.2 α-硫辛酸對(duì)小鼠外傷后線粒體與去線粒體細(xì)胞質(zhì)中Cytochrome c 和Bax 的變化水平的影響線粒體中外傷+溶劑組Cytochrome c 表達(dá)較假手術(shù)+溶劑組和假手術(shù)+α-硫辛酸組明顯降低，而Bax 的表達(dá)則明顯增加(P ＜0.01);外傷+α-硫辛酸組中Cytochrome c 表達(dá)較外傷+溶劑組明顯增加，而Bax表達(dá)則明顯減少(P ＜0.05)。在去線粒體細(xì)胞質(zhì)中，外傷+溶劑組Cytochrome c 表達(dá)較假手術(shù)+溶劑組和假手術(shù)+α-硫辛酸組明顯增加，而Bax 的表達(dá)則明顯減少(P ＜0.01);外傷+α-硫辛酸組中Cytochrome c 表達(dá)較外傷+溶劑組明顯減少，而Bax表達(dá)則明顯增加(P ＜0.05)。假手術(shù)+溶劑組與假手術(shù)+α-硫辛酸組之間Cytochrome c 和Bax 的蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見圖1，表1。

圖1 Western blot 檢測(cè)α-硫辛酸對(duì)小鼠外傷后線粒體與去線粒體細(xì)胞質(zhì)中Cytochrome c 和Bax 的變化水平的影響Figure 1 Effects of alpha lipoic acid on the levels of cytochrome c and Bax in mitochondria and cytosol after traumatic brain injury in mice

表1 Western blot 檢測(cè)α-硫辛酸對(duì)小鼠外傷后線粒體與去線粒體細(xì)胞質(zhì)中Cytochrome c 和Bax 的變化水平的影響Table 1 Effects of alpha lipoic acid on the levels of cytochrome c and Bax in mitochondria and cytosol after traumatic brain injury in mice

表1 Western blot 檢測(cè)α-硫辛酸對(duì)小鼠外傷后線粒體與去線粒體細(xì)胞質(zhì)中Cytochrome c 和Bax 的變化水平的影響Table 1 Effects of alpha lipoic acid on the levels of cytochrome c and Bax in mitochondria and cytosol after traumatic brain injury in mice

與外傷+溶劑組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 n Cytochrome線c粒體BaxCytochr去om線e c粒 體細(xì)胞質(zhì)Bax假手術(shù)+溶劑組 5 0.95±0.31＊＊0.97±0.22＊＊ 0.96±0.17＊＊1.01±0.13＊＊假手術(shù)+α-硫辛酸組 5 0.98±0.24＊＊0.91±0.26＊＊ 0.92±0.25＊＊0.96±0.19＊＊外傷+溶劑組 5 0.44±0.78 2.11±0.33 1.71±0.20 0.43±0.14外傷+α-硫辛酸組 5 0.82±0.23* 1.26±0.36* 1.20±0.22* 0.77±0.17*

2.3 Caspase-3 的免疫組化檢測(cè) 外傷+溶劑組Caspase-3 陽性細(xì)胞的表達(dá)［(58.40±7.31)%］高于外傷+α-硫辛酸組［(47.42±7.74)%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);亦高于假手術(shù)+溶劑組［(10.25 ±2.19)%］和假手術(shù)+α-硫辛酸組［(10.23±1.21)%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。假手術(shù)+溶劑組和假手術(shù)+α-硫辛酸組之間Caspase-3 的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見圖2。

圖2 免疫組化法檢測(cè)Caspase-3 的表達(dá)(×400)Figure 2 Caspase-3 expression detected by immunohistochemistry(×400)

2.4 α-硫辛酸對(duì)小鼠外傷后神經(jīng)元細(xì)胞存活的影響外傷+溶劑組神經(jīng)元存活率［(44.45±10.56)%］低于外傷+α-硫辛酸組［(57.46±11.01)%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);亦明顯低于假手術(shù)+溶劑組［(92.91±2.46)%］、假手術(shù)+α-硫辛酸組［(91.50±2.62)%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。假手術(shù)+溶劑組和假手術(shù)+α-硫辛酸組之間神經(jīng)元的存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖3 尼氏染色檢測(cè)神經(jīng)元存活情況(×400)Figure 3 Neuron survival detected by Nissl staining(×400)

2.5 TUNEL 檢測(cè)α-硫辛酸對(duì)外傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 外傷+溶劑組小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)［(59.63±8.61)%］高于外傷+α-硫辛酸組［(44.86±7.32)%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);亦明顯高于假手術(shù)+溶劑組［(11.46±3.15)%］和假手術(shù)+α-硫辛酸組［(9.11±3.14)%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。假手術(shù)+溶劑組與假手術(shù)+α-硫辛酸組之間細(xì)胞凋亡指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見圖4。

圖4 TUNEL 檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況(×400)Figure 4 Apoptosis of neural cells detected by TUNEL(×400)

3 討 論

TBI 引起的腦損傷可分為原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷，原發(fā)性腦損傷是由外力的直接作用造成的，可以直接導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡，是一種不可逆的損傷過程。而繼發(fā)性腦損傷是在原發(fā)性損傷基礎(chǔ)上的進(jìn)一步發(fā)展，是一個(gè)潛在的可逆的過程。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生與線粒體損傷、活性氧及鈣超載等有著密切聯(lián)系［8-10］，可見繼發(fā)性腦損傷可通過多條細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑引起神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，而且這個(gè)過程可能存在許多可調(diào)控的靶點(diǎn)。因此通過對(duì)遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)通路進(jìn)行干預(yù)，現(xiàn)已成為研究治療TBI 的靶點(diǎn)。

線粒體是細(xì)胞的能量工廠，其功能是把有機(jī)化合物氧化產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)化為ATP。線粒體調(diào)節(jié)膜電位并控制細(xì)胞程序性死亡，當(dāng)受到不良刺激，線粒體內(nèi)膜與外膜接觸位點(diǎn)處生成通透性轉(zhuǎn)變孔道，會(huì)使線粒體內(nèi)膜通透性提高，引起線粒體跨膜電位的耗散，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［11］。線粒體膜通透性增加也能使誘導(dǎo)凋亡因子(apoptosis-inducing factor，AIF)等分子釋放進(jìn)入細(xì)胞基質(zhì)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。Bax 屬于bcl-2 家族，具有孔形成能力［12］，并能誘導(dǎo)Cytochrome c 從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)，在dATP 存在時(shí)與凋亡蛋白酶激活因子結(jié)合并激活Caspase-9，后者再激活Caspase-3 而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。AIF 通過促進(jìn)線粒體釋放Cytochrome c 而增強(qiáng)凋亡信號(hào)，并可快速激活核酸內(nèi)切酶。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TBI 后線粒體Bax 表達(dá)增加，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)減少，可提示外傷后Bax 在線粒體上可能形成了孔道;而線粒體Cytochrome c 表達(dá)減少，細(xì)胞質(zhì)中增多，也可提示外傷Cytochrome c 從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)。而且通過檢測(cè)Caspse-3 的表達(dá)和神經(jīng)元的存活率也恰好證明前面所述。

α-硫辛酸是一種很強(qiáng)的抗氧化劑，既有水溶性又有脂溶性，且具有顯著的親電性和與自由基反應(yīng)的能力。目前有研究表明α-硫辛酸對(duì)心、腦、腎的缺血再灌注損傷［13-16］、糖尿病及其神經(jīng)并發(fā)癥［17］、中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病［18］等均有較強(qiáng)的保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，在小鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型中給予α-硫辛酸治療后，小鼠腦水腫明顯改善，同時(shí)線粒體Bax 的表達(dá)下降，釋放到細(xì)胞質(zhì)的Cytochrome c 明顯減少，在免疫組化染色可見Caspase-3陽性細(xì)胞的表達(dá)量降低，且神經(jīng)元存活率明顯增高?？梢姦?硫辛酸對(duì)外傷后引起的腦神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用，其可能機(jī)制為α-硫辛酸通過抑制線粒體凋亡途徑而起抗凋亡作用。這為我們今后研究TBI 的治療提供依據(jù)，同時(shí)α-硫辛酸在TBI 的治療效果還有待進(jìn)一步的研究。

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