周經(jīng)委，吳蓉花，郭 里，孫 琴，丁曉萌，隨劉才，陳 莉

0 引 言

自1978 年首例試管嬰兒出生以來，試管嬰兒技術(shù)經(jīng)長期的發(fā)展，從第1 代試管嬰兒到第3 代試管嬰兒，輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technologies，ART)給許多不孕夫婦帶來了希望。然而研究顯示ART 子代有潛在的出生缺陷及較差的生存質(zhì)量［1］，由體外受精(in vitro fertilization，IVF)和胚胎移植所帶來的問題越來越引起人們的關(guān)注。植入前的環(huán)境與胚胎的生長與代謝有關(guān)［2］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明IVF 子代有患2 型糖尿病、肥胖、胰島素抵抗以及冠心病的風(fēng)險(xiǎn)［3-4］。流行病學(xué)調(diào)查研究表明:ART 會引起子代的缺陷及相關(guān)疾病，包括出生缺陷、威廉氏癥侯群綜合征、甲狀腺功能缺陷、心血管疾病等一系列并發(fā)癥［5-7］。也有報(bào)道顯示ART 對子代的相關(guān)功能無影響，馮玉芳等［8］發(fā)現(xiàn)IVF 對性成熟期子代小鼠的血清生化指標(biāo)無影響。Beydoun 等［9］觀察第1 代試管嬰兒子代青春期無提前或退遲。近年來玻璃化冷凍技術(shù)在臨床上得到廣泛的應(yīng)用，對于不孕患者行冷凍胚胎移植，避免了卵巢再次接受過度刺激，有報(bào)道稱冷凍胚胎移植成功率高于新鮮胚胎移植［10］。相比傳統(tǒng)的冷凍方法，玻璃化冷凍技術(shù)有較高的懷孕率和較理想的出生率［11-12］。然而，玻璃化冷凍胚胎會導(dǎo)致H19 和IGF2 的異常甲基化［13］。全胚玻璃化冷凍是胚胎在較高濃度的冷凍保護(hù)劑作用下快速降溫，使胚胎內(nèi)外的水分直接形成玻璃態(tài)，避免冰晶形成對胚胎的損傷。

為了進(jìn)一步了解ART 以及胚胎冷凍是否會對子代生長發(fā)育和機(jī)體代謝產(chǎn)生影響，本研究比較了ART 和自然受孕小鼠子代的生長發(fā)育情況以及新胚和凍胚移植后子代的生長發(fā)育情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性SPF 級6 周齡昆明種小鼠20 只，健康SPF 級雌性8 周齡昆明種小鼠42只，健康SPF 級雄性10 周齡昆明種小鼠21 只，均購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號:SCXK(蘇)2011-0003。購買后的小鼠于南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，飼養(yǎng)密度＜6 只/盒，相對濕度40%～60%，溫度20 ～24 ℃，以配方飼料飼養(yǎng)，自由采食和飲水，自動(dòng)光控(12 h 明/12 h 暗)。本實(shí)驗(yàn)通過南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.1.2 藥品與試劑 孕馬血清(Pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)、促性腺激素(Human menopausal gonadotropin，HCG)(寧波第二激素廠);水合氯醛(國藥集團(tuán)有限公司);玻璃化冷凍及解凍試劑(加藤公司，日本);Quinn's 系列胚胎體外操作液及培養(yǎng)液(Sigma 公司，美國)。

1.1.3 儀器與設(shè)備 電子天平(福州普利斯特有限公司);Minispec 小核磁分析儀(Bruker 公司，德國);培養(yǎng)箱(三洋公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 10 周齡的雄鼠(5 只)與8 周齡的雌鼠(10 只)合籠后，次日清晨檢查雌鼠陰栓，獲得孕鼠4 只，產(chǎn)仔量分別為12、8、11、10 只(共41只)，從中隨機(jī)選擇4、2、3、3 只共12 只仔鼠作為對照組。將10 周齡的雄鼠進(jìn)行輸精管結(jié)扎，結(jié)扎2 周后投入使用，結(jié)扎雄鼠(10 只)與發(fā)情期雌鼠(20只)合籠，次日清晨檢查雌鼠陰栓，2.5 d 后進(jìn)行胚胎移植，記為假孕雌鼠。選擇性成熟期的雄鼠單籠飼養(yǎng)1 周以上為供精鼠。選擇間情期的6 周齡雌鼠進(jìn)行超促排卵，第1 天18:00 注射PMSG10 U/只，48 h后注射HCG10 U/只，第4 天上午取供精鼠附睪尾處的精子上游1 h，取超促排卵過的雌鼠卵與精子結(jié)合后培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為:溫度:37 ℃，CO2濃度:5%，飽和濕度。共獲得囊胚62 枚。隨機(jī)分為2 組，一組直接移植到假孕雌鼠子宮內(nèi)，共獲得4 只孕鼠，產(chǎn)仔量分別為7、7、6、7 只(共27 只)，從中隨機(jī)選擇了2、3、2、2 只仔鼠共9 只仔鼠作為鮮胚移植組;另一組按玻璃化冷凍程序直接凍于液氮中，待移植日在常溫下進(jìn)行解凍，解凍后的囊胚于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h 左右，待胚胎完全擴(kuò)張后進(jìn)行移植，待分娩。共獲得4 只孕鼠，產(chǎn)仔量分別為7、8、6、7 只(共28只)，從中隨機(jī)選擇了3、4、2、3 只共12 只，仔鼠作為凍胚移植組。

1.2.2 體重測定 子代小鼠從出生開始每周固定日上午用電子天平記錄體重變化，連續(xù)12 周。

1.2.3 體脂測定 子代小鼠生長到8 周(性成熟期)，用小核磁分析儀檢測脂肪與肌肉的分布情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。當(dāng)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時(shí)，進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較視方差齊性檢驗(yàn)(以0.1 作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行Levene 檢驗(yàn)):當(dāng)方差齊同時(shí)，選擇LSD 檢驗(yàn);當(dāng)方差不齊時(shí)，選擇Tamhane'sT2 檢驗(yàn)。當(dāng)不符合正態(tài)分布時(shí)，將數(shù)據(jù)進(jìn)行Lg 轉(zhuǎn)換之后，符合正態(tài)的進(jìn)行單因素方差分析，如不符合，采用非參數(shù)檢驗(yàn)，以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 凍胚移植組與新胚移植組移植的囊胚 新胚移植組胚胎與凍胚移植組復(fù)蘇后胚胎在高倍顯微鏡下的形態(tài)無明顯差異。

圖1 冷凍胚胎移植組和新鮮胚胎移植的囊胚形態(tài)(×1000)Figure 1 Morphology of the vitrified versus fresh embryos(×1000)

2.2 子代小鼠體重的變化 凍胚移植組體重均高于同時(shí)期對照組(P ＜0.01)。鮮胚移植組小鼠在0周、2 ～6 周體重均高于對照組(P ＜0.05)。7 ～12周較對照組體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。凍胚移植組較鮮胚移植組體重增加更為明顯。見表1。

表1 各組子代小鼠體重的變化，g)Table 1 Body weight of the mouse offspring in different groups at different postnatal weeks，g)

表1 各組子代小鼠體重的變化，g)Table 1 Body weight of the mouse offspring in different groups at different postnatal weeks，g)

與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

出生時(shí)間 體重(周)對照組(n=12) 凍胚移植組(n=12) 鮮胚移植組(n=9)0 2.07±0.10 2.44±0.25＊＊ 2.46±0.32＊＊1 6.16±0.31 9.58±1.05＊＊ 7.38±1.19 2 9.20±0.61 16.16±1.42＊＊ 14.38±2.36＊＊3 16.88±0.67 23.49±1.71＊＊ 22.77±3.13＊＊4 26.61±0.73 35.38±3.17＊＊ 33.58±3.29*5 30.55±1.55 40.93±3.80＊＊ 37.10±4.63*6 32.46±1.54 44.75±3.42＊＊ 38.73±3.57*7 34.69±2.60 48.13±4.60＊＊ 41.67±3.95 8 36.15±1.01 50.50±4.96＊＊ 42.93±4.40 9 37.75±2.29 52.99±4.14＊＊ 45.50±3.95 10 39.40±2.99 53.36±4.35＊＊ 47.39±4.42 11 39.94±3.46 56.22±4.02＊＊ 47.83±4.78 12 40.38±3.56 57.71±4.37＊＊49.59±4.91

2.3 子代小鼠體脂含量的變化 用核磁分析儀掃描小鼠體脂的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)凍胚移植組脂肪及肌肉的含量顯著性高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01);鮮胚移植組較對照組脂肪及肌肉的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);鮮胚移植組脂肪分布明顯低于凍胚移植組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，而肌肉的分布在組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表2。

表2 8 周齡子代小鼠體脂和肌肉分布比較，g)Table 2 Contents of body fat and muscle of the mouse offspring in different groups at 8 postnatal weeks，g)

表2 8 周齡子代小鼠體脂和肌肉分布比較，g)Table 2 Contents of body fat and muscle of the mouse offspring in different groups at 8 postnatal weeks，g)

與對應(yīng)對照組比較，*P ＜0.01;與凍胚移植組比較，#P ＜0.05

組別 體脂分布(g) 肌肉分布(g)對照組2.80±0.48 27.50±1.79凍胚移植組 9.32±4.34* 33.77±4.22*鮮胚移植組 5.24±2.56#31.25±3.78

3 討 論

研究表明父母遺傳或胚胎培養(yǎng)環(huán)境、父母的配子接受顯微治療會增加ART 兒童的出生缺陷［14］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明IVF 子代胚胎期的重量高于自然生產(chǎn)的子代［15］，有研究顯示IVF 兒童的代謝綜合征、胰島素抵抗以及慢性炎癥的患病率并未增加［6］。IVF 子代多為多胞胎和早產(chǎn)，且他們很少接受母乳喂養(yǎng)，故導(dǎo)致此類研究較為復(fù)雜。

本研究發(fā)現(xiàn)IVF 凍胚移植的子代小鼠體重出現(xiàn)了較明顯的升高，而鮮胚移植組對小鼠子代的影響在出生6 周后得到修正，可能與子代的“追趕式生長”有關(guān)，而凍胚移植組未出現(xiàn)這種生長趨勢，我們發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍移植組的體重變化比鮮胚移植組更加顯著，這種變化是否與玻璃化冷凍技術(shù)有關(guān)本身有關(guān)仍需進(jìn)一步研究。對4 ～14 歲的IVF 和自然生產(chǎn)的子代研究表明，他們的脂肪分布無差異［2］。Donjacour 等［16］用雙能X 線掃描不同培養(yǎng)基的IVF 子代全身脂肪分布發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，IVF 子代的脂肪含量逐漸升高。Scherrer 等［18］通過對體外培養(yǎng)獲得的12 月齡的子代小鼠研究發(fā)現(xiàn)，ART 小鼠的肥胖率高于自然生產(chǎn)的子代［19］。ART 會導(dǎo)致兒童血管功能損害，IVF 過程同一些子代的并發(fā)癥如低出生體重、2 型糖尿病、肥胖、胰島素抵抗、Beckwith-Wiedemann 和Angelman 綜合征相關(guān)［20-22］。

早期的生長狀況與成年期疾病的發(fā)生相關(guān)［23］。體脂指標(biāo)的變化可能會產(chǎn)生胰島素［24］，在第2 代試管嬰兒的子代在青春期出現(xiàn)了身體脂肪分布的改變［25］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IVF 凍胚子代的體脂含量高于對照組和鮮胚移植組，而鮮胚移植組同對照組并未出現(xiàn)差異，結(jié)果表明玻璃化冷凍技術(shù)對子代的影響要早于新鮮移植周期的子代，但本研究樣本量較少，尚需大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。鮮胚移植組和凍胚移植組產(chǎn)仔量均低于對照組，而產(chǎn)仔量的多少與子代的體重相關(guān)，體重與體脂的分布是密不可分的，在本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組體重的變化是與IVF 本身相關(guān)還是同產(chǎn)仔量相關(guān)，尚需更深入地研究。

本研究比較IVF 2 種移植方式，研究其從出生到成年期體重的變化，發(fā)現(xiàn)凍胚移植技術(shù)對子代的干擾較大，為了探討其變化的原因，我們選擇了性成熟期體脂的分布變化，發(fā)現(xiàn)脂肪組織是引起體重變化的主要原因，但本研究持續(xù)時(shí)間較短，一些指標(biāo)可能要到中老年期才能表現(xiàn)出來，今后需要長期的監(jiān)測代謝相關(guān)指標(biāo)的變化，且產(chǎn)仔量可能對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。玻璃化冷凍技術(shù)作為一項(xiàng)在臨床應(yīng)用非常成熟的技術(shù)，其對子代的影響值得重視，本研究發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍技術(shù)對子代生長發(fā)育影響要大于鮮胚移植，但本實(shí)驗(yàn)并不能完全模擬人體環(huán)境，到底是親本本身的因素還是體外操作干擾子代的生長發(fā)育還值得商榷。

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