陳 玉綜述，徐方平，劉艷輝審校

0 引 言

隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，人類(lèi)的研究重點(diǎn)從基因組圖譜深入到功能基因組的領(lǐng)域?；虮磉_(dá)產(chǎn)物-蛋白質(zhì)參與了生物體內(nèi)幾乎全部的生命活動(dòng)，而蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用在整個(gè)機(jī)體生理和病理過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。近年來(lái)，腫瘤基因組學(xué)、靶向治療等方面的研究顯著擴(kuò)大了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用在腫瘤治療中的應(yīng)用。大量的基礎(chǔ)及臨床研究用于確定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，以明確誘導(dǎo)及維持腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵樞紐及節(jié)點(diǎn)，而這些關(guān)鍵的樞紐及節(jié)點(diǎn)有望成為腫瘤診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)及靶向藥物治療的分子標(biāo)志物［1］。傳統(tǒng)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用方法有酵母雙雜交系統(tǒng)、免疫共沉淀、Western blot 等，但這些方法都破壞了細(xì)胞的自然狀態(tài)，無(wú)法反映活細(xì)胞生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的時(shí)空動(dòng)態(tài)信息，也無(wú)法進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位。近年來(lái)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)技術(shù)的研發(fā)解決了以上問(wèn)題。FRET 通過(guò)非輻射能量轉(zhuǎn)移原理，可以定時(shí)、定量、定位、動(dòng)態(tài)地觀察活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用［2］。FRET 技術(shù)在生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域中得到快速發(fā)展，應(yīng)用日益廣泛。2013 年Science 報(bào)道了結(jié)合FRET 與超寬帶超速紫外線(xiàn)二維光譜儀，捕捉到肌紅蛋白中色氨酸與亞鐵血紅素之間的瞬時(shí)超速電子轉(zhuǎn)移，有助于研究蛋白質(zhì)中色氨酸介導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)移，從而擴(kuò)大了FRET在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及動(dòng)力學(xué)如蛋白質(zhì)折疊等研究中的應(yīng)用［3］。文中就FRET 技術(shù)的原理及應(yīng)用，尤其是在腫瘤研究中的應(yīng)用作一綜述。

1 FRET 的技術(shù)原理

FRET 指的是2 個(gè)熒光團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移。當(dāng)2 個(gè)熒光發(fā)射基團(tuán)足夠靠近時(shí)，作為能量供體的分子吸收了一定頻率的激發(fā)光后激發(fā)到更高的電子能態(tài)，通過(guò)振蕩偶極子作用將能量轉(zhuǎn)移給處于基態(tài)的作為能量受體的分子，發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移［4］。FRET發(fā)生需有以下3 個(gè)必要條件:首先，2 個(gè)熒光團(tuán)之間距離必須足夠近，一般為1 ～10 nm;其次，供體與受體之間存在適當(dāng)?shù)亩ㄎ环较?第三，供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜(又稱(chēng)吸收光譜)之間必須有相當(dāng)程度的重疊［5］。FRET 的效率(E)是指供體經(jīng)FRET 轉(zhuǎn)移給受體的能量占供體釋放總能量的比例，E 的計(jì)算公式為:

(Ro 為F?rster 距離常數(shù)，R 為供體與受體的實(shí)際距離)

其中相當(dāng)于受體接受50%FRET 能量時(shí)與供體的距離，與供體及受體本身特性、媒介的折射指數(shù)、供體發(fā)射光譜與受體激發(fā)光譜重疊程度、供體與受體相對(duì)定位角度等相關(guān)，通常為2 ～8 nm［6］。由此可見(jiàn)，F(xiàn)RET 的效率主要依賴(lài)于供體與受體的距離及相對(duì)定位。

盡管FRET 理論早在20 世紀(jì)已提出，但這項(xiàng)技術(shù)在活細(xì)胞中的應(yīng)用是在1992 年首次從一種學(xué)名為Aequorea victoria 的水母中克隆出完整的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因后才大力發(fā)展起來(lái)的［7］。因GFP 具備發(fā)光無(wú)需輔助因子及作用底物，易于在活細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，且與之構(gòu)建的融合蛋白在活細(xì)胞內(nèi)仍正常行使功能等特性，故成為一個(gè)極佳的在活細(xì)胞內(nèi)觀察蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的報(bào)告分子。近年來(lái)發(fā)展出多種GFP 的突變體，可發(fā)出不同顏色的熒光，其中應(yīng)用最廣的是青色熒光蛋白(cyan fluorescent protein，CFP)和黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)。CFP 的發(fā)射光譜與YFP 的吸收光譜有相當(dāng)程度重疊，可參與融合蛋白的構(gòu)建。當(dāng)2 個(gè)分別融合了CFP、YFP的蛋白相互作用時(shí)，所融合的CFP、YFP 隨之相互靠近，激發(fā)CFP 吸收波長(zhǎng)433 nm 的激發(fā)光后發(fā)生FRET，檢測(cè)到波長(zhǎng)為527 nm 的YFP 熒光。

2 FRET 的應(yīng)用

FRET 可實(shí)時(shí)檢測(cè)2 個(gè)生物大分子間的相互作用，也可研究分子內(nèi)部變化，因此在生物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用廣泛，其在活細(xì)胞水平研究蛋白激酶活性、蛋白質(zhì)磷酸化、蛋白質(zhì)構(gòu)象、鈣離子濃度測(cè)定及蛋白質(zhì)之間的相互作用都有應(yīng)用。而在腫瘤的研究中，分子機(jī)制、信號(hào)傳導(dǎo)通路已成為研究熱點(diǎn)，人們認(rèn)為腫瘤基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的信號(hào)分子很可能成為抗癌藥物的作用靶點(diǎn)，基于FRET 原理設(shè)計(jì)的生物傳感器可將活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的作用活性可視化，更助于活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的研究［8］。因此，在腫瘤診斷、預(yù)后及靶向藥物治療等領(lǐng)域的FRET 應(yīng)用也越來(lái)越多。2.1 FRET 在腫瘤基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用 蛋白激酶是大多數(shù)生物信號(hào)通路的核心，在許多腫瘤的病理機(jī)制中起至關(guān)重要的作用。最近，熒光報(bào)告分子與基于FRET 原理設(shè)計(jì)的生物傳感器的發(fā)展為在生理?xiàng)l件下觀察蛋白激酶活性及動(dòng)態(tài)行為提供了大量成像方法，可達(dá)到實(shí)時(shí)、高時(shí)空分辨率及不破壞其自然生理結(jié)構(gòu)及功能條件下檢測(cè)蛋白激酶活性。熒光生物傳感器可用于研究生理及病理狀態(tài)下蛋白激酶的活性、結(jié)構(gòu)及功能。應(yīng)用FRET 原理，Zhang 等［7］設(shè)計(jì)出幾種基因編碼的探針用于研究蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、Src、Abl、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)等4 種已知酪氨酸激酶的活性。這種探針包含一個(gè)相關(guān)蛋白激酶特異的底物結(jié)構(gòu)域，一個(gè)與底物相結(jié)合的磷酸化識(shí)別結(jié)構(gòu)域，以及兩端分別相連CFP、YFP 或其變異體。當(dāng)?shù)孜锪姿峄螅肿觾?nèi)底物結(jié)構(gòu)域與磷酸化識(shí)別結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，兩端的CFP、YFP 靠近產(chǎn)生FRET。在生長(zhǎng)因子刺激誘導(dǎo)下，以上幾種酪氨酸激酶被激活，利用FRET 探針可檢測(cè)到25%～35%的活性變化。

然而，敏感的FRET 生物傳感器由于設(shè)計(jì)困難，阻礙了FRET 在腫瘤研究中的廣泛應(yīng)用。FRET 效率不僅與受體、供體間的距離相關(guān)，還與兩者相對(duì)位置有關(guān)，在依賴(lài)距離的模型中，傳感器與配體結(jié)合導(dǎo)致FRET 增加;在依賴(lài)相對(duì)位置的模型中，傳感器與配體結(jié)合之前FRET 已經(jīng)增高，來(lái)源于GFP 的熒光蛋白易于相互形成二聚化物，而這種二聚化作用會(huì)加強(qiáng)FRET 效應(yīng)［9］。由于缺乏FRET 生物傳感器的三維結(jié)構(gòu)，很難預(yù)測(cè)何種模型會(huì)占主導(dǎo)地位。Komatsu 等［10］設(shè)計(jì)了一個(gè)較長(zhǎng)的連接傳感器與配體結(jié)構(gòu)域的連接器(EV 連接器)克服了以上困難。EV連接器由116 個(gè)氨基酸組成，可消除熒光基團(tuán)的二聚化作用，使FRET 效率主要依賴(lài)距離。該研究促進(jìn)了FRET 技術(shù)在激酶及三磷酸鳥(niǎo)苷酶中的應(yīng)用，幫助破譯活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的作用。Kazuhir等［11］在此基礎(chǔ)上改進(jìn)了多種FRET 生物傳感器的設(shè)計(jì)，使其監(jiān)測(cè)癌基因產(chǎn)物的活性效果更佳。如為檢測(cè)Ras 活性的FRET 生物傳感器Raichu-Ras，其顯示在表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)誘導(dǎo)下板狀偽足上的Ras 活性增高，且受體YFP/供體CFP 的比值反映了FRET 效率。生物傳感器Prin-c-Raf 可監(jiān)測(cè)與Ras 結(jié)合誘導(dǎo)的c-Raf 構(gòu)象改變，且FRET 效率與c-Raf 活性呈負(fù)相關(guān)，由此可觀察到c-Raf 在細(xì)胞質(zhì)膜上的分布及構(gòu)象變化。Picchu-CrkII 同樣用于監(jiān)測(cè)CrkII 致癌基因產(chǎn)物的構(gòu)象改變。CrkII 是EGFR 的底物，在EGF 刺激的作用下可觀察細(xì)胞質(zhì)膜上CrkII 磷酸化作用廣泛地增加，因此，通過(guò)觀察CrkII 磷酸化水平可反映EGFR活性。該研究團(tuán)隊(duì)還設(shè)計(jì)了幾種新的FRET 生物傳感器以檢測(cè)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，如RSK、S6K、AKt、PKC 等，其中S6K 可有助于mTORC1 信號(hào)通路活性的可視化［10］。

同理，Kumagai 等［12］設(shè)計(jì)了檢測(cè)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)活性的FRET 生物探針，并建立表達(dá)該探針的小鼠乳腺腫瘤病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)-Neu 轉(zhuǎn)基因小鼠模型，后者常用于人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2)/Neu 陽(yáng)性的乳腺癌研究，而HER2/Neu 的轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)信號(hào)主要通過(guò)Ras-Raf-MEK-ERK 信號(hào)通路調(diào)控。該研究發(fā)現(xiàn)ERKhigh的細(xì)胞在體內(nèi)、體外均較ERKlow細(xì)胞成瘤速度慢，推測(cè)高ERK 活性可能抑制乳腺癌干細(xì)胞的自我更新。

FRET 不僅可以用于蛋白質(zhì)間相互作用的研究，還可用于研究DNA、RNA 間的相互作用。Huang等［13］首次利用雙鏈RNA 作為FRET 探針，定量檢測(cè)健康人及腫瘤患者血清中的位點(diǎn)特異性核糖核酸酶A(RNase A)活性，發(fā)現(xiàn)胃癌、肝癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌、腎癌及肺癌患者血清中RNase 活性顯著降低，而乳腺癌、結(jié)腸癌患者則輕微降低，從而推測(cè)RNase A 將來(lái)有可能作為檢測(cè)某些特定腫瘤的生物標(biāo)記，幫助腫瘤的早期診斷。

細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的生命活動(dòng)是通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)來(lái)調(diào)節(jié)的，該網(wǎng)絡(luò)常常是2 個(gè)以上的多種蛋白質(zhì)之間相互作用。最近發(fā)展起來(lái)的三色FRET技術(shù)(three-chromophore FRET)可研究3 種不同蛋白質(zhì)之間的相互作用。三色FRET 技術(shù)是通過(guò)將3 種熒光蛋白分別標(biāo)記3 個(gè)不同的生物分子，觀察到3 種熒光蛋白之間連貫發(fā)生2 次FRET 過(guò)程，從而推測(cè)3 個(gè)生物分子之間的相互作用關(guān)系。這一技術(shù)方法有助于研究更為復(fù)雜的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系。Lopez-Gimenez 等［14］利用連續(xù)三色FRET 技術(shù)研究證實(shí)腎上腺素受體α1b(G 蛋白偶聯(lián)受體)是以高階寡聚物的形式而不是二聚化形式存在，其寡聚化效應(yīng)與受體蛋白成熟、質(zhì)膜表面?zhèn)鬟f以及信號(hào)傳導(dǎo)功能相關(guān)?？缒^(qū)Ⅰ及跨膜區(qū)Ⅳ共同突變?yōu)轱@著負(fù)效應(yīng)突變體，而僅有跨膜區(qū)Ⅰ突變不足以產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)，跨膜區(qū)Ⅳ單獨(dú)突變則可阻礙質(zhì)膜表面信號(hào)傳遞。

2.2 FRET 在腫瘤診斷及藥物研發(fā)中的應(yīng)用 除了在以上這些基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用，基于FRET 原理的熒光生物傳感器還為腫瘤早期診斷、疾病進(jìn)展、監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)、高通量篩查候選藥物及評(píng)估藥物成分等研究提供了強(qiáng)有力的工具。Mizutani 等［15］首次將基于FRET 原理設(shè)計(jì)的可檢測(cè)BCR-ABL 激酶活性的基因編碼生物傳感器應(yīng)用于臨床。CrkL 是BCRABL 酪氨酸激酶的底物，其磷酸化在癌基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到重要的作用，具有致癌潛能［16］。甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylat，IM)為一種經(jīng)過(guò)認(rèn)證的酪氨酸激酶抑制劑，可阻礙BCR-ABL 的ATP 結(jié)合位點(diǎn)，用于費(fèi)城染色體陽(yáng)性慢性髓細(xì)胞性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)的治療［17］，但CML加速期或急變期患者易出現(xiàn)耐藥，目前對(duì)耐藥機(jī)制的研究認(rèn)為是ABL 激酶結(jié)構(gòu)域的點(diǎn)突變阻礙了其與分子靶向藥物的結(jié)合［18］。因此，對(duì)于IM 治療無(wú)效的患者應(yīng)及時(shí)應(yīng)用第二代治療藥物如尼羅替尼(nilotinib，NL)、達(dá)沙替尼(dasatinib，DS)等［19］。Mizutani 等［15］構(gòu)建了一個(gè)包含CrkL 的蛋白，其中CrkL 兩端分別連接Venus(YFP 的變異體)及增強(qiáng)型CFP。當(dāng)BCR-ABL 存在時(shí)，CrkL 的SH2 結(jié)構(gòu)域在分子內(nèi)與磷酸化的酪氨酸(Y207)結(jié)合，其兩端的Venus 及CFP 距離靠近，F(xiàn)RET 效應(yīng)增強(qiáng)。該融合蛋白可用于檢測(cè)IM 抑制BCR-ABL 激酶活性的效能，IM 導(dǎo)致FRET 效能的減少是劑量依賴(lài)性的，當(dāng)IM的濃度≥0.1 μmol/L 時(shí)，即可觀察到FRET 效應(yīng)顯著減少。而用免疫印跡或流式細(xì)胞儀方法檢測(cè)內(nèi)源性CrkL 磷酸化狀態(tài)時(shí)，要求IM 的濃度至少達(dá)到0.5 μmol/L 才能觀察到顯著性差異。應(yīng)用延時(shí)雙重發(fā)射熒光顯微鏡可顯示IM 治療期間FRET 效應(yīng)減少的時(shí)間動(dòng)態(tài)改變，24 h 后大部分細(xì)胞內(nèi)FRET 效應(yīng)已被IM 完全抑制。因此，應(yīng)用FRET 方法及生物探針評(píng)估CML 分子靶向治療藥物的效果是高度敏感且實(shí)用的。將缺乏BCR-ABL 表達(dá)的細(xì)胞(293F)的FRET 平均發(fā)射比值(D-FRET)作為閾值，低于該值的細(xì)胞稱(chēng)為FRETlo，高于該值的細(xì)胞稱(chēng)為FREThi。通過(guò)觀察表達(dá)BCR-ABL 的CML 細(xì)胞群中FREThi細(xì)胞的比例可幫助及時(shí)發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞及篩選第二代治療藥物。FRET 方法可評(píng)估單個(gè)細(xì)胞中藥物的直接效應(yīng)，而免疫印跡、流式細(xì)胞儀等方法需要固定、溶解或透化細(xì)胞，可能導(dǎo)致BCR-ABL 蛋白快速降解從而低估了BCR-ABL 蛋白水平，F(xiàn)RET 可檢測(cè)生理狀態(tài)下的活細(xì)胞內(nèi)BCR-ABL 蛋白狀態(tài)。該研究還發(fā)現(xiàn)帶有G250E 點(diǎn)突變的BCR-ABL 蛋白對(duì)NL 的敏感性是依賴(lài)其劑量濃度的，從而可以解釋O'Hare等［20］研究發(fā)現(xiàn)G250E 點(diǎn)突變對(duì)NL 敏感而Redaelli等［21］的研究結(jié)論卻與之相反的爭(zhēng)議［16］。因此，應(yīng)用FRET 原理及FRET 生物探針?lè)椒捎糜贑ML 的診斷、監(jiān)視抗癌藥物的治療反應(yīng)及耐藥細(xì)胞的檢測(cè)，并進(jìn)一步用于直接評(píng)估激酶抑制劑效應(yīng)，幫助預(yù)測(cè)采用第二代抑制劑或新的針對(duì)耐藥突變治療藥物的種類(lèi)與時(shí)間。近年來(lái)，F(xiàn)RET 技術(shù)也陸續(xù)用于其他腫瘤的藥物研發(fā)如胰腺癌［22］、乳腺癌［12］等。

2.3 FRET 聯(lián)合其他技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用FRET 還可與其他技術(shù)結(jié)合，如聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、流式細(xì)胞儀技術(shù)、生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移、近紅外技術(shù)等，擴(kuò)大其應(yīng)用領(lǐng)域。以下簡(jiǎn)單介紹幾種FRET 與其他技術(shù)結(jié)合在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的應(yīng)用。

DNA 甲基化是一種調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳修飾，啟動(dòng)子區(qū)域的異常甲基化經(jīng)常發(fā)生于富于CG(又稱(chēng)CpG 島)的片段，可干擾基因轉(zhuǎn)錄并直接導(dǎo)致基因沉默。這種甲基化常發(fā)生于抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)域，不僅與腫瘤發(fā)生相關(guān)，還與腫瘤分級(jí)、分期、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等預(yù)后有關(guān)。而這一表觀遺傳學(xué)改變發(fā)生于腫瘤形成之前，可視為一種潛在的生物標(biāo)記物，并可應(yīng)用于腫瘤的預(yù)防和治療［23］。隨著表觀遺傳學(xué)修飾方法在骨髓增生異常綜合征治療中的應(yīng)用已通過(guò)FDA 認(rèn)證，檢測(cè)抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域異常高甲基化狀態(tài)已成為癌癥早期診斷、監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展及靶向治療的工具。Bailey 及其研究團(tuán)隊(duì)將高特異性的甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)與高靈敏度的量子點(diǎn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(quantum dot FRET，QD-FRET)結(jié)合，形成甲基化特異性的量子點(diǎn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(methylation specific quantum dot FRET，MS-qFRET)方法，可定性和定量地檢測(cè)甲基化DNA［24］。在MS-qFRET 中，經(jīng)亞硫酸氫鈉處理的DNA，未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化的胞嘧啶不發(fā)生轉(zhuǎn)變，通過(guò)PCR 擴(kuò)增，其中正向引物經(jīng)過(guò)生物素化，逆向引物標(biāo)記了有機(jī)熒光團(tuán)Cy5，與鏈親和素結(jié)合的量子點(diǎn)可捕捉標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，量子點(diǎn)作為供體，將能量轉(zhuǎn)移給經(jīng)擴(kuò)增后與產(chǎn)物融合的受體Cy5，因此，根據(jù)FRET 水平可確定DNA 甲基化狀態(tài)。在此研究中，P15INK4B啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)可作為急性髓細(xì)胞性白血病的預(yù)測(cè)及預(yù)后指標(biāo)，且與FRET 效能呈直線(xiàn)相關(guān)，應(yīng)用MS-qFRET 方法可檢測(cè)DNA 豐富的樣本如腫瘤組織或細(xì)胞株中的P15INK4B甲基化狀態(tài)，也可用于DNA 稀少的樣本如血清、唾液中P15INK4B甲基化狀態(tài)的檢測(cè)。因此，MS-qFRET 在臨床診斷、預(yù)后方面的應(yīng)用具有巨大的潛力。

近紅外技術(shù)是指利用生物組織對(duì)700 ～900 nm近紅外區(qū)光子量吸收最弱，近紅外光可穿透組織層，從而對(duì)深部腫瘤成像。由于其在生物組織內(nèi)較少吸收和輻射，將近紅外染料與FRET 技術(shù)結(jié)合，較其他熒光染料優(yōu)勢(shì)明顯。NF-κB 蛋白是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其家族蛋白在細(xì)胞增殖及抑制凋亡中發(fā)揮重要作用［25］。NF-κB 信號(hào)通路的激活主要依賴(lài)于p50蛋白的活化［26］。利用近紅外染料Cy5.5 和Cy7 分別作為供著和受者與雙鏈寡聚核苷酸探針連接，后者可與p50 蛋白特異結(jié)合，當(dāng)p50 蛋白加入后，可觀察到FRET。從而可研究p50 蛋白與寡核苷酸的相互作用。

FRET 與實(shí)時(shí)PCR 結(jié)合，可同時(shí)對(duì)濾泡性淋巴瘤標(biāo)本中BCL-2 基因重排、MBR/JH 易位進(jìn)行定性和定量檢測(cè)［27］。利用FRET 探針進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并結(jié)合SYBR GreenⅠ熒光蛋白溶解曲線(xiàn)分析，可快速、簡(jiǎn)單、有效地檢測(cè)出骨髓或外周血中的腫瘤細(xì)胞，有助于評(píng)估患者腫瘤進(jìn)展及治療情況。

3 展 望

綜上所述，F(xiàn)RET 技術(shù)已在生物醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究、疾病診斷(尤其是惡性腫瘤的早期發(fā)現(xiàn))、藥物研發(fā)等方面有廣泛的應(yīng)用，但其本身仍存在一些挑戰(zhàn)，如生物傳感器的設(shè)計(jì)、高效轉(zhuǎn)染表達(dá)穩(wěn)定的細(xì)胞、FRET 存在背景噪聲需要校正的問(wèn)題等，特別是FRET 要求發(fā)生于特定相對(duì)位置且距離在1 ～10 nm的熒光基團(tuán)間，這一嚴(yán)格要求有可能產(chǎn)生假陰性現(xiàn)象，如2 個(gè)生物分子相對(duì)位置不合適或作用距離﹥10 nm 等。目前已有許多研究針對(duì)以上問(wèn)題提出各種解決方法，使FRET 的應(yīng)用得到重大的進(jìn)展。相信隨著對(duì)腫瘤信號(hào)通路、信號(hào)分子活性的研究進(jìn)展，F(xiàn)RET 在活細(xì)胞水平揭示腫瘤信號(hào)通路尤其是下游蛋白水平相互作用關(guān)系等方面的地位越來(lái)越突出，從而幫助闡明腫瘤發(fā)病機(jī)制、耐藥機(jī)制，因此在腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)及藥物研發(fā)中擁有巨大的潛力。通過(guò)EGFR-Ras-ERK、mTOR［10］、Cdk 家族［28］等信號(hào)通路的研究，F(xiàn)RET 將用于更多的惡性腫瘤如肺癌、淋巴瘤的藥物研發(fā)。在藥效監(jiān)測(cè)方面，F(xiàn)RET 可用非侵入性樣本如血清檢測(cè)相關(guān)生物標(biāo)記物活性以便早期發(fā)現(xiàn)耐藥及篩選藥物，因此擁有廣大的臨床應(yīng)用前景。

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