鄧 琳，黃蘇揚(yáng)，孔慶濤，李宗輝，桑 紅

0 引 言

念珠菌是常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性致病真菌之一，是人體的共生菌群，正常情況下可寄生于體表、口腔、泌尿生殖道、胃腸道等部位，在免疫缺陷的患者中，念珠菌可以引起從皮膚黏膜到威脅生命的播散性感染。其中白念珠菌是器官移植患者侵襲性真菌感染的首要原因［1］。目前，念珠菌感染致病因子有表型轉(zhuǎn)換、粘附性、侵襲性酶的分泌、生物被膜的形成等。近年的研究發(fā)現(xiàn)念珠菌可以產(chǎn)生黑色素，推測(cè)黑色素可能與念珠菌致病性相關(guān)［2］，但其具體機(jī)制和相關(guān)因素尚不明確。

黑色素是一類在動(dòng)植物和微生物普遍存在的深褐色至黑色為主的色素，依據(jù)其合成底物和中間產(chǎn)物的不同而分為不同的種類。黑色素具有抗氧化、抗溶菌酶、吸收紫外線、抵御宿主免疫攻擊等生物學(xué)功能［3］。黑色素與許多真菌的致病毒力有關(guān)，如新生隱球菌、著色芽生菌、馬拉色菌等;黑色素在真菌侵入宿主和抵御環(huán)境的不良影響方面具有重要作用［4］。本研究通過(guò)搜集不同部位不同種臨床念珠菌菌株，在3種產(chǎn)黑培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，并通過(guò)觀察超微結(jié)構(gòu)變化進(jìn)一步研究念珠菌和黑色素之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株1 株，SC5314;新生隱球菌標(biāo)準(zhǔn)株1 株，BLS71 血清型A，由衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)微生物菌(毒)種保藏管理中心真菌中心(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所)提供。臨床分離念珠菌株360 株，標(biāo)本均來(lái)自本院。標(biāo)本來(lái)源包括口腔、陰道、尿等部位。

1.1.2 主要試劑及儀器 葡萄糖、蛋白胨、瓊脂粉、MgSO4、KH2PO4、L-DOPA、天冬氨酸、甘氨酸、咖啡酸、米粉、吐溫80、科馬嘉顯色培養(yǎng)基、蒸餾水、恒溫培養(yǎng)箱(上海柏欣儀器設(shè)備廠)、細(xì)胞計(jì)數(shù)板(美國(guó)corning incorporated)、透射電子顯微鏡(TEM，日本電子JEM-2100)、電子自旋共振波譜儀(ESR，德國(guó)Magnettech，MiniScope MS300)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備 用葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1000 mL;將瓊脂加入蒸餾水中，加熱溶解，再加入其他成分溶解后調(diào)整pH值至5.5 ～6.0，高壓滅菌，121 ℃，15 min，冷卻后倒無(wú)菌平皿，置4 ℃制成沙氏培養(yǎng)基。依照參考文獻(xiàn)［5］制備保存多巴培養(yǎng)基和咖啡酸培養(yǎng)基。依照參照文獻(xiàn)［6］制備保存添加多巴的基本培養(yǎng)基。

1.2.2 培養(yǎng) 所有菌株接種沙氏培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)24 ～48 h，挑取菌落轉(zhuǎn)種科瑪嘉顯色培養(yǎng)基進(jìn)行鑒定，檢出360 株念珠菌株構(gòu)成。

1.2.3 接種 所有菌株經(jīng)活化后，以無(wú)菌蒸餾水制成2×106cfu/mL 菌懸液，用移液槍取30 μL 菌懸液接種于已凝固的多巴培養(yǎng)基、咖啡酸培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基上，每個(gè)菌株每種培養(yǎng)基接種3 份，置入35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 觀察方法 多巴培養(yǎng)基、咖啡酸培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基于接種第3、5、7、10 天觀察顏色變化并拍照。

1.2.5 透射電子顯微鏡 對(duì)多巴培養(yǎng)基上產(chǎn)黑的新生隱球菌、白念珠菌SC5314 和菌落疑似變黑的念珠菌，用無(wú)菌蒸餾水沖洗、離心收集后2.5%戊二醛在4 ℃下固定24 h 按照文獻(xiàn)［7］處理后，在透射電鏡下觀察拍照。

1.2.6 電子自旋共振波譜儀 用電子自旋共振波譜儀對(duì)變黑最明顯的SC5314 進(jìn)行檢測(cè)。將冷凍干燥的0.3 g 黑色素樣品加入波譜儀管中，擦凈管外壁，置于諧振腔中。波譜儀工作參數(shù)如下，磁場(chǎng):中心磁場(chǎng)3509.8 G，掃場(chǎng)寬度200 G;微波輻射:微波頻數(shù)9.5 ～10.0 GHz，功率0.4 ～1.0 mW;信號(hào)通道:時(shí)間常數(shù)40.960 ms，掃描時(shí)間41.943 s;信號(hào)接收:調(diào)制頻數(shù)100 kHz，調(diào)制振幅0.2 ～1.0 mT，增益103～105;溫度:室溫［8］。

2 結(jié) 果

2.1 念珠菌的菌株分布和不同來(lái)源變黑情況 多巴培養(yǎng)基:臨床念珠菌12 株變黑(陰道4 株、口腔3株、尿液3 株、血液1 株、趾甲1 株)，均為白念珠菌;基本培養(yǎng)基:15 株變黑(陰道5 株、尿液5 株、口腔4 株、血液1 株)，均為白念珠菌。上述12 株和15株臨床念珠菌無(wú)重復(fù)，且部位之間重疊。見(jiàn)表1。

表1 360 株念珠菌菌株及不同部位變黑情況比較［n(%)］Table 1 Pigmentation of the 360 strains of clinically isolated Candidas n(%)

2.2 產(chǎn)黑素的結(jié)果 第3 天時(shí)，新生隱球菌在3 種產(chǎn)黑培養(yǎng)基上開(kāi)始變?yōu)樽睾稚?第5 天時(shí)，白念珠菌SC5314 在多巴和添加多巴的基本培養(yǎng)基上變?yōu)樽睾稚? 天開(kāi)始黑色，其余臨床念珠菌仍未顯色，見(jiàn)圖1。第10 天時(shí)，360 株念珠菌中12 株在多巴培養(yǎng)基上變?yōu)樽睾稚?15 株在基本培養(yǎng)基上變棕褐色，見(jiàn)圖2;除新生隱球菌變?yōu)樽睾稚猓琒C5314 和臨床念珠菌在咖啡酸培養(yǎng)基上均未變色。

圖1 新生隱球菌、SC5314 和其余臨床念珠菌在3 種培養(yǎng)基培養(yǎng)上的菌落圖Figure 1 Cryptococcus neoformans，SC5314，and clinically isolated Candidas in the three types of culture media

圖2 培養(yǎng)10 d 的臨床念珠菌菌落Figure 2 Clinically isolated Candidas at 10 days in DOPA agar and minimal medium

2.3 透射電子顯微鏡結(jié)果 在透射電子顯微鏡下，產(chǎn)黑的新生隱球菌可見(jiàn)細(xì)胞壁的外層有一高電子密度層，而SC5314 和變色的臨床念珠菌中未出現(xiàn)相似的結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖3。

2.4 電子自旋共振波譜結(jié)果 參照文獻(xiàn)［7］已報(bào)道陽(yáng)性對(duì)照新生隱球菌能檢測(cè)到信號(hào)，而本研究中產(chǎn)黑最明顯的SC5314，未檢測(cè)到波普信號(hào)，見(jiàn)圖4。

圖3 新生隱球菌、SC5314 和臨床念珠菌的透射電鏡圖Figure 3 Cryptococcus neoformans，SC5314，and clinically isolated Candidas under the transmission electron microscope

圖4 新生隱球菌和SC5314 的電子自旋共振波譜Figure 4 Cryptococcus neoformans and SC5314 under the electron spin resonance spectroscope

3 討 論

念珠菌屬是引發(fā)人類侵襲性真菌感染的最常見(jiàn)的病原菌。念珠菌感染中主要由白念珠菌所致，約占50%～70%［9］。然而最近10 余年臨床分離的念珠菌屬中非白念珠菌呈增多趨勢(shì)［10］;本研究搜集的360 株念珠菌，其中白念珠菌占48.6%，非白念珠菌占51.4%，非白念珠菌比例高于白念珠菌，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［10］。本研究360 株念珠菌中以口腔最多，陰道和尿液次之?？梢?jiàn)念珠菌容易侵襲呼吸道、泌尿系統(tǒng)，可能由于患呼吸道泌尿系統(tǒng)疾病患者居多或抗生素不合理應(yīng)用，抵抗能力低下所致，有關(guān)具體原因尚待進(jìn)一步研究。

黑色素能抵抗日光和紫外線的輻射損傷，具有抗電離輻射作用［11－12］。黑色素與多種病原真菌的致病性緊密相關(guān)，例如構(gòu)巢曲霉、煙曲霉［13－14］、新生隱球菌、念珠菌［15］。

Morris-Jones 等［2］首先證實(shí)白念珠菌在體外和體內(nèi)均可合成黑色素，其黑色素與其他病原真菌產(chǎn)生的黑色素具有相同的抗原性，推測(cè)其與白念珠菌致病性相關(guān)，但其研究未對(duì)黑色素進(jìn)行波譜檢測(cè)。國(guó)內(nèi)關(guān)于念珠菌與黑色素的關(guān)系尚未研究。本研究360 株念珠菌中，多巴培養(yǎng)基上12 株和基本培養(yǎng)基上15 株變?yōu)樽睾稚瑑烧咧g菌株無(wú)重復(fù)，且均為白念珠菌。其中第5 天時(shí)，SC5314 在多巴培養(yǎng)基和添加多巴的基本培養(yǎng)基上開(kāi)始變棕褐色，第7 天時(shí)變黑色，取SC5134 變黑最明顯時(shí)和變黑的臨床念珠菌做透射電鏡，結(jié)果顯示在透射電鏡下未在細(xì)胞壁外見(jiàn)到黑色素顆粒。

2010 年，Walker 等［16］觀察到白念珠菌SC5314在含多巴的培養(yǎng)基上經(jīng)4 ～8 d 產(chǎn)生黑色素，在透射電鏡下可見(jiàn)白念珠菌SC5314 細(xì)胞壁外存在黑色素顆粒。但其推測(cè)黑色素可能只是一種代謝產(chǎn)物，白念珠菌在細(xì)胞內(nèi)形成黑素小體，穿過(guò)細(xì)胞壁在細(xì)胞外釋放黑色素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果念珠菌變黑的原因可能與多巴見(jiàn)光氧化分解有關(guān)，并非黑色素;此外根據(jù)Walker 的推測(cè)也有可能是SC5314 在細(xì)胞內(nèi)形成黑素小體，釋放到細(xì)胞外后未結(jié)合到細(xì)胞壁上，故在透射電鏡下未看到黑色素顆粒。關(guān)于其變黑的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

Walker 等［16］的實(shí)驗(yàn)中SC5314 是在液體基本培養(yǎng)基中，置入200 轉(zhuǎn)搖床37 度下培養(yǎng)，由于旋轉(zhuǎn)過(guò)程中液體培養(yǎng)基不穩(wěn)定，故其電鏡表面的黑色素顆粒可能在旋轉(zhuǎn)的過(guò)程中粘附在細(xì)胞壁的表面。而本研究中，使用的培養(yǎng)基均為固體培養(yǎng)基，置入35 度恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。使用固體培養(yǎng)基在靜態(tài)下培養(yǎng)，比在液體培養(yǎng)基旋轉(zhuǎn)條件下培養(yǎng)更穩(wěn)定，更能反應(yīng)真菌生長(zhǎng)真實(shí)情況。

此外，黑色素是一種帶負(fù)電荷穩(wěn)定的有機(jī)自由基，不溶于水和有機(jī)溶劑，對(duì)濃酸抵抗，對(duì)氧化劑敏感，具有電子自旋共振特性［17］。有研究者已用ESR 波譜法證明電子從溶液中的自由基轉(zhuǎn)移到新生隱球菌黑素［18］。本研究對(duì)變黑最為明顯的SC5314 檢測(cè)波譜，結(jié)果顯示未檢測(cè)到其信號(hào)。

本研究分離360 株念珠菌進(jìn)行研究，樣本量少，還需要繼續(xù)加大樣本進(jìn)行篩選。同時(shí)，還可進(jìn)一步用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證黑色素，用抗黑色素單克隆抗體標(biāo)記變色的念珠菌，加入熒光素異硫氰酸鹽免疫球蛋白IgM，在熒光顯微鏡下觀察是否有黑色素顆粒存在［19］。

黑色素被認(rèn)為是許多病原真菌的毒力因子，在病原真菌的致病過(guò)程中擔(dān)任著重要角色。念珠菌與黑色素的關(guān)系，以及其合成機(jī)制、是否存在類似編碼漆酶的基因及其在致病機(jī)制中的作用還需進(jìn)一步研究。

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