田 豐，周 凱，車曉玲，傅 點(diǎn)，程 文，周文泉，張征宇，秦衛(wèi)軍，王龍信

0 引 言

轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一種具有多種功能的細(xì)胞因子，其對(duì)免疫細(xì)胞有強(qiáng)大的免疫抑制作用，能夠被多數(shù)腫瘤大量分泌而逃避宿主的免疫監(jiān)視［1］。CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)是機(jī)體針對(duì)腫瘤免疫的重要的效應(yīng)細(xì)胞，但由于TGF-β 的免疫抑制功能，其作用被明顯抑制［2］。我們構(gòu)建了對(duì)TGF-β 不敏感的腫瘤特異性的CTL 細(xì)胞，通過檢測(cè)對(duì)比CTL 對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用及小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子的變化了解TGF-β 信號(hào)通路被阻斷后免疫細(xì)胞的治療作用的變化。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康雄性Balb/c 小鼠，體重:16 ～20g，鼠齡:6 ～8 周，共60 只，購于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(軍)2008-016。飼養(yǎng)于超凈動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室層流架內(nèi)，保持恒溫(25±2)℃、恒濕(45%～50%)，應(yīng)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飲食進(jìn)行飼養(yǎng)，無菌工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.1.2 細(xì)胞 小鼠腎癌細(xì)胞系Renca、前列腺癌細(xì)胞系TRAMP-C2 購自于ATCC 公司，以10%FCS PRMI1640 于pH 7.2 ～7.4、37 ℃、5%CO2、100%濕度條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以細(xì)胞平鋪生長至培養(yǎng)瓶底面積80%為標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.3 主要藥品及試劑 修飾的TβRⅡ質(zhì)粒由美國西北大學(xué)張強(qiáng)博士惠贈(zèng)。粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factorα，TNF-α)及白細(xì)胞介素4(interleukin-4，IL-4)、IL-2均購于英國Peprotech 公司。DMEM、1640 培養(yǎng)基購于Gibco 公司。胎牛血清(FBS)購于Hyclone公司。抗Smad-2 和磷酸化Smad-2 的單克隆抗體購自BD Pharmingen 公司。CD8+T Cell Isolation Kit 購自R＆D 公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立 于小鼠右腋部皮下注射0.1 mL(5×106個(gè)/L)Renca 細(xì)胞懸液，1 周后腫瘤大小接近10 ～20 mm，建立腎癌皮下荷瘤Balb/c 小鼠模型。

1.2.2 DC 細(xì)胞分離、培養(yǎng)及抗原負(fù)載 頸椎脫位處死小鼠，無菌取脾，用梯度密度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×109個(gè)/L，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)3 h，移去懸浮細(xì)胞，加入含10%FCS 的1640 培養(yǎng)液、rm-IL-4(1000 U/mL)、rm-GM-CSF(1000 U/mL)，隔日半量換液，第5 天后按10∶1 比例加入反復(fù)凍融獲得Renca 細(xì)胞裂解物，第6 天加入TNF-α，第7 天收集懸浮細(xì)胞，即為負(fù)載腎癌抗原的DC 細(xì)胞(TP-DC)。

1.2.3 CTL 細(xì)胞分離、培養(yǎng)及致敏 頸椎脫位處死Balb/c 小鼠，無菌取脾，制備脾細(xì)胞懸液，去除細(xì)胞團(tuán)或碎片并裂解紅細(xì)胞。清洗細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將脾細(xì)胞置于冷的1×MagCellectBuffer 中，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至20×107個(gè)/mL;將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至5mL 離心管中，加入200 μL/mL MagCellectCD8+Cocktail，2 ～8 ℃冰箱孵育15 min;向細(xì)胞懸液中加入250 μL MagCellect Ferrofluid，2 ～8 ℃冰箱孵育15 min;孵育后期向試管中加入1.55 mL 1×MagCellectBuffer 使反應(yīng)容積達(dá)到3 mL，將反應(yīng)試管水平放置于磁力架上，室溫(18 ～25 ℃)孵育6 min;保存離心管于磁場(chǎng)中，將上清移至5 mL 離心管中，重復(fù)最后步驟獲得CD8+CTL 細(xì)胞。應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定。將TP-DC與CTL 以1∶10 比例加入含IL-2(500 U/mL)的10%FCS 1640 培養(yǎng)基中共同孵育，獲得腫瘤敏感的CTL細(xì)胞(tumor pulsed cytotoxic T lymphocyte，TP-CTL)。

1.2.4 TβRⅡ質(zhì)粒構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 在FuGENE 6 作用下用修飾的TβRⅡ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293 包裝細(xì)胞，32 ℃下孵化24 h 后收集漂浮在表面的病毒，0.45 μm過濾器過濾，在聚凝胺作用下轉(zhuǎn)染293 細(xì)胞，32 ℃下孵化48 h，10%DMEM 培養(yǎng)基37 ℃下孵化過夜，同樣條件再次轉(zhuǎn)染293 細(xì)胞24 h，收集漂浮在表面的病毒，0.45 μm 過濾器過濾，獲得重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。

1.2.5 阻斷TGF-β 信號(hào)通路的腫瘤特異性CTL 細(xì)胞的獲得 已經(jīng)致敏的TP-CTL 細(xì)胞(1×106個(gè)/mL)置于預(yù)涂纖維蛋白碎片的培養(yǎng)基內(nèi)，加入同樣體積的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，5%CO2、37 ℃下孵化48 h，獲得表達(dá)顯性負(fù)相TGF-βⅡ型受體的腫瘤特異性的CTL細(xì)胞(TGF-β type Ⅱreceptor domain negative-CTL，TβRⅡDN-CTL)。

1.2.6 TβRⅡDN-CTL 細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn) 用TGF-β1(10 ng/mL)對(duì)TP-CTL 及TβRⅡDN-CTL 細(xì)胞進(jìn)行增殖抑制實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用10 ng/mL 的TGF-β 與轉(zhuǎn)染前后的TβRⅡDN-CTL 細(xì)胞孵育16 h后裂解細(xì)胞，用抗Smad-2 和磷酸化Smad-2 的單克隆抗體做Western blot 檢測(cè)。通過Cr51釋放實(shí)驗(yàn)測(cè)定TP-CTL 及TβRⅡDN-CTL 對(duì)腎癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，靶效比(T 細(xì)胞/腫瘤細(xì)胞)從1∶1 至100∶1，以無關(guān)腫瘤細(xì)胞株小鼠前列腺癌TRAMP-C2 細(xì)胞作為非特異性對(duì)照。

1.2.7 TβRⅡDN-CTL 細(xì)胞對(duì)小鼠體內(nèi)IL-2 和INF-γ水平的影響 將已成瘤的動(dòng)物模型按隨機(jī)數(shù)字表法分為2 組，每組10 只。分別于第1、3、7 天于尾靜脈過繼性注射TP-CTL 及TβRⅡDN-CTL 2×106個(gè)/只。3 周后應(yīng)用ELISA 法檢測(cè)小鼠體內(nèi)IL-2 和INF-γ 水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 12.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，組間均數(shù)比較采用單因素的方差分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 分離獲得的DC、CTL 細(xì)胞及TβRⅡDN 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè) 倒置顯微鏡下可見分離獲得的CTL 大小均勻小球形，而新鮮分離培養(yǎng)的DC 可見懸浮球形細(xì)胞表面有樹突狀或毛刺狀突起，見圖1。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CTL 的TβRⅡDN 轉(zhuǎn)染效率為92.3%。見圖2。

2.2 TGF-β 對(duì)TβRⅡDN-CTL 細(xì)胞增殖影響 將正在培養(yǎng)的阻斷TGF-β 信號(hào)通路的TβRⅡDN-CTL 及TP-CTL 培養(yǎng)基中加入TGF-β1(10 ng/mL)，觀察2 種細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果表明TGF-β1對(duì)TβRⅡDN-CTL細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見圖3。

2.3 阻斷TGF-β 信號(hào)通路后Smad-2 磷酸化情況

TP-CTL 細(xì)胞與TGF-β1以10 ng/mL 共同孵育16 h 后可以檢測(cè)到Smad-2 和磷酸化Smad-2。而轉(zhuǎn)染后表達(dá)TβRⅡDN 的CTL 細(xì)胞與同樣劑量TGF-β1孵育后只能檢測(cè)到Smad-2，而未檢測(cè)到磷酸化的Smad-2，說明TGF-β 的信號(hào)通路被阻斷。見圖4。

圖1 倒置顯微鏡下觀察分離獲得的CTL 及DC 細(xì)胞Figure 1 Cytotoxic T lymphocytes and dendritic cells under the inverted microscope

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)TβRⅡDN 轉(zhuǎn)染效率Figure 2 Transfection efficiency of TβRⅡDN by flow cytometry

圖3 TGF-β1對(duì)TP-CTL 和TβRⅡDN-CTL 細(xì)胞增殖數(shù)量的影響Figure 3 Effects of TGF-β1 on the proliferation of tumor lysate-pulsed cytotoxic T lymphocytes (TPCTLs)and TβRⅡDN-CTLs

圖4 Western blot 檢測(cè)不同CTL 細(xì)胞Smad-2 及其磷酸化情況Figure 4 hosphorylation of Smad-2 in tumor lysate-pulsed cytotoxic T lymphocytes(TP-CTLs)and TβRⅡDN-CTLs

2.4 TGF-β 信號(hào)通路對(duì)CTL 殺傷能力的影響TP-CTL 和TβRⅡDN-CTL 對(duì)腎癌Renca 細(xì)胞均有特異性的細(xì)胞毒作用，且殺傷率隨著E/T 比率的增加而升高，TβRⅡDN-CTL 對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒作用與TP-CTL 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。TβRⅡDN-CTL 及TP-CTL 對(duì)無關(guān)的小鼠前列腺癌TRAMPC2 細(xì)胞無明顯殺傷作用。見表1、表2。

表1 TβRⅡDN-CTL 與TP-CTL 對(duì)相關(guān)腫瘤細(xì)胞Renca 特異性殺傷效率，%)Table 1 Renal cancer-specific killing effects of tumor lysate-pulsed cytotoxic T lymphocytes(TP-CTLs)and TβRⅡDNCTLs，%)

表1 TβRⅡDN-CTL 與TP-CTL 對(duì)相關(guān)腫瘤細(xì)胞Renca 特異性殺傷效率，%)Table 1 Renal cancer-specific killing effects of tumor lysate-pulsed cytotoxic T lymphocytes(TP-CTLs)and TβRⅡDNCTLs，%)

與TβRⅡDN-CTL 組比較，*P ＜0.01

組別1∶1 20∶1不同效5靶0∶比1殺傷率75∶1 100∶1 TTβP-RCⅡTLD 組N- CT L 組 8 4..55 00±±00..55 84 *11 6..57 00±±00..84 22 *31 20..62 00±±30..0943 *41 14..49 00±±41..01 6 2*51 07..47 00±±41..44 8 2*

表2 TβRⅡDN-CTL 與TP-CTL 對(duì)無關(guān)腫瘤細(xì)胞TRAMP-C2 殺傷效率，%)Table 2 Killing effects of tumor lysate-pulsed cytotoxic T lymphocytes(TP-CTLs)and TβRⅡDN-CTLs on non-tumor cells TRAMP-C2，%)

表2 TβRⅡDN-CTL 與TP-CTL 對(duì)無關(guān)腫瘤細(xì)胞TRAMP-C2 殺傷效率，%)Table 2 Killing effects of tumor lysate-pulsed cytotoxic T lymphocytes(TP-CTLs)and TβRⅡDN-CTLs on non-tumor cells TRAMP-C2，%)

組別1∶1 20∶1不同效5靶0∶比1殺傷率75∶1 100∶1 TβRⅡDN-CTL 組 1.20±0.09 2.30±0.11 3.50±0.17 4.20±0.25 7.30±0.31 TP-CTL 組 0.70±0.05 1.10±0.08 1.50±0.10 1.80±0.11 2.30±0.15

2.5 CTL 過繼性免疫后小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子變化情況 過繼性輸注TP-CTL 和TβRⅡDN-CTL 荷瘤小鼠體內(nèi)檢測(cè)IL-2 和INF-γ 水平相比，TβRⅡDN-CTL較TP-CTL 升高更為明顯(P ＜0.01)。見圖5。

圖5 過繼性免疫后荷瘤小鼠體內(nèi)INF-γ 和IL-2 水平Figure 5 Levels of serum IL-2 and INF-γ in the tumorbearing mice after adoptive transfusion of tumor lysate-pulsed cytotoxic T lymphocytes (TPCTLs)and TβRⅡDN-CTLs

3 討 論

過繼性免疫治療是腫瘤免疫治療中一種有前景的治療方法，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)中都已經(jīng)被廣泛證實(shí)有效［3］。機(jī)體中最終消滅腫瘤細(xì)胞的免疫細(xì)胞是CTL 細(xì)胞。在過繼性免疫治療中很多類型的免疫細(xì)胞都被應(yīng)用過，包括淋巴因子激活的CTL細(xì)胞、腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞等，并且取得了一定的療效［4－7］。盡管免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤能夠產(chǎn)生殺傷作用，但腫瘤很多的免疫逃逸機(jī)制仍然能夠超過這些免疫反應(yīng)最終促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［8－9］。腫瘤來源的免疫抑制因子是其中最重要的因素之一［10－11］。

TGF-β 是一種多效的細(xì)胞因子，具有重要的生理功能。同時(shí)TGF-β 也是腫瘤產(chǎn)生的一種強(qiáng)大的免疫抑制因子［1］，能夠明顯抑制免疫細(xì)胞的活性達(dá)到逃避殺傷的目的［2，10］。它能通過TGF-β/Smad 信號(hào)通路來影響細(xì)胞核內(nèi)的靶基因，從而顯著抑制CTL 殺傷活性［12］。首先TGF-β 與CTL 細(xì)胞表面的Ⅱ型受體(TβRⅡ)結(jié)合，通過磷酸化使下游細(xì)胞質(zhì)中的Smad 蛋白被激活。Smad 蛋白是TGF-β 受體復(fù)合物的下游信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白，它可以把胞膜上的信號(hào)直接傳導(dǎo)至細(xì)胞核，活化了的Smads 復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核后，聯(lián)合細(xì)胞核內(nèi)其他的轉(zhuǎn)錄因子一起調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄來影響細(xì)胞周期［13－14］，從而影響CTL 的殺傷效率。本實(shí)驗(yàn)將TβR Ⅱ基因在cDNA 597nt 處切去頂端，然后轉(zhuǎn)染給CTL 細(xì)胞，使TβRⅡ顯性負(fù)向表達(dá)來阻斷該信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以達(dá)到消除TGF-β 對(duì)CTL 影響的作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)由于阻斷了信號(hào)通路，在TβRⅡDN-CTL 中Western blot沒有檢測(cè)出磷酸化的Smad-2。在增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β 對(duì)TβRⅡDN-CTL 細(xì)胞增殖沒有明顯影響，從另外一個(gè)角度證實(shí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被阻斷。當(dāng)免疫抑制因子的影響被消除后，免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷作用將明顯提高。在本實(shí)驗(yàn)中，阻斷TGF-β信號(hào)通路的CTL 細(xì)胞特異性的腫瘤殺傷效率明顯提高，而且將其過繼性回輸給荷瘤小鼠后，小鼠體內(nèi)的IL-2 和INF-γ 水平也明顯上升。IL-2 和INF-γ 均可由CTL 分泌，同時(shí)也對(duì)CTL 起到激活的作用，這對(duì)CTL 的殺傷效率提高起到作用［15］。本研究結(jié)果證實(shí)，阻斷CTL 的TGF-β 的信號(hào)通路，明顯提高腫瘤反應(yīng)性CTL 的殺傷效率，并同時(shí)提高體內(nèi)免疫因子的水平。

通過將腫瘤反應(yīng)性CTL 應(yīng)用包含顯性負(fù)相TβRⅡ基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染而使其TGF-β 信號(hào)被阻斷，實(shí)現(xiàn)了CTL 對(duì)腫瘤分泌的強(qiáng)效免疫抑制因子TGF-β 不敏感，從而顯著提高CTL 的殺傷效率。這種新方法對(duì)過繼性腫瘤免疫治療提供了新思路，具有重大的臨床意義與應(yīng)用價(jià)值。

［1］ Pickup M，Novitskiy S，Moses HL.The roles of TGF-β in the tumour microenvironment［J］.Nat Rev Cancer，2013，13(11):788-799.

［2］ Oh SA，Li MO.TGF-β:guardian of T cell function［J］.J Immunol，2013，191(8):3973-3979.

［3］ Kalos M，June CH.Adoptive T cell transfer for cancer immunotherapy in the era of synthetic biology［J］.Immunity，2013，39(1):49-60.

［4］ Rosenberg SA，Dudley ME.Adoptive cell therapy for the treatment of patients with metastatic melanoma［J］.Curr Opin Immunol，2009，21(2):233-240.

［5］ Junker N，Andersen MH，Wenandy L，et al.Bimodal ex vivo expansion of T cells from patients with head and neck squamous cell carcinoma:a prerequisite for adoptive cell transfer［J］.Cytotherapy，2011，13(7):822-834.

［6］ Polak ME，Borthwick NJ，Jager MJ，et al.Melanoma vaccines:The problems of local immunosuppression［J］.Hum Immunol，2009，70(5):331-339.

［7］ 董 杰，王龍信，唐朝朋，等.轉(zhuǎn)化生長因子β 不敏感的樹突狀細(xì)胞疫苗對(duì)腎細(xì)胞癌荷瘤小鼠細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞的影響［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26(5):455-459.

［8］ Payne KK，Toor AA，Wang XY，et al.Immunotherapy of cancer:reprogramming tumor-immune crosstalk［J］.Clin Dev Immunol，2012，2012:760965.

［9］ Kaufman HL.Vaccines for melanoma and renal cell carcinoma［J］.Semin Oncol，2012，39(3):263-275.

［10］ Kudo-Saito C，Shirako H，Ohike M，et al.CCL2 is critical for immunosuppression to promote cancer metastasis［J］.Clin Exp Metastasis，2013，30(4):393-405.

［11］ Tian F，Wang L，Qin W，et al.Vaccination with transforming growth factor-beta insensitive dendritic cells suppresses pulmonary metastases of renal carcinoma in mice［J］.Cancer Lett，2008，271(2):333-341.

［12］ Wang L，Wen W，Yuan J，et al.Immunotherapy for human renal cell carcinoma by adoptive transfer of autologous transforming growth factor beta insensitive CD8+T cells in humanized SCID mice［J］.Clin Cancer Res，2010，16(1):164-173.

［13］ Matsuzaki K.Smad phospho-isoforms direct context-dependent TGF-β signaling［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2013，24(4):385-399.

［14］ 董 杰，王龍信，唐朝朋，等.CT 在肺癌腎上腺轉(zhuǎn)移診斷中的應(yīng)用［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26(1):109-110.

［15］ Takata H，Naruto T，Takiguchi M.Functional heterogeneity of human effector CD8+T cells［J］.Blood，2012，119(6):1390-1398.