曾紅亮　張怡　薛雅茹　劉駿　鄭寶東

摘 要 為研究堿溶液提取金柑多糖的最佳工藝，考察液料比、提取時(shí)間、提取溫度、NaOH濃度和提取次數(shù)等5個(gè)因素對金柑多糖得率的影響。在單因素研究的基礎(chǔ)上，采用五元二次旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計(jì)對其工藝進(jìn)行優(yōu)化，利用SAS 9.2響應(yīng)面分析程序得到回歸方程。結(jié)果表明：回歸方程達(dá)到顯著水平，多糖的最佳堿提取工藝條件為：液料比（V/W）41 ∶ 1，提取時(shí)間3.5 h，提取溫度89 ℃，NaOH濃度0.05 mol/L，提取次數(shù)3次。在此條件下，多糖得率為（8.56±0.23）%，與理論預(yù)測值基本一致，相比傳統(tǒng)熱水浸提法，多糖得率提高3.73倍。

關(guān)鍵詞 金柑；多糖；堿提；響應(yīng)面

中圖分類號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Optimization of the Alkali Extraction Technology of

Fortunella margarita Polysaccharides via

Response Surface Methodology

ZENG Hongliang， ZHANG Yi， XUE Yaru， LIU Jun， ZHENG Baodong*

College of Food Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract In order to study the optimum technology conditions of Fortunella margarita polysaccharides extracted by NaOH solution， the effect of liquid/material ratio， extraction time， extraction temperature， NaOH concentration and extraction times on the yield of F. margarita polysaccharides was investigated， respectively. On the basis of the single factor experiments， the conditions were optimized by the quadratic orthogonal rotation design with five factors. A regression equation was established by response surface methodology in SAS 9.2. The results showed that the equation reached significant level and the optimum conditions were as follows： liquid/material ratio of 41 ∶ 1（mL ∶ g）， extraction time of 3.5 h， extraction temperature of 89 ℃， NaOH concentration of 0.05 mol/L and 3-attempts extraction. Under the conditions， the yield of polysaccharides could be up to（8.56±0.23）%， which was consistent with the theoretical prediction value and increased by 3.73 times compared with the traditional hot water extraction method.

Key words Fortunella margarita； Polysaccharides； Alkali extraction； Response surface methodology

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.030

金柑（Fortunella margarita）又名金橘、夏橘，屬蕓香科常綠小喬木或灌木，柑橘族，金柑屬植物，原產(chǎn)于中國，主要栽培在浙江、廣西、江西、湖南、福建、廣東等?。▍^(qū)）[1-2]。金柑營養(yǎng)價(jià)值很高，含有人體所需多種維生素、氨基酸以及豐富的多糖、精油、檸檬苦素、黃酮等活性物質(zhì)[3-6]。金柑對防止血管破裂，減少毛細(xì)血管脆性和通透性，減緩血管硬化有良好的作用；對血壓能產(chǎn)生雙向調(diào)節(jié)作用，高血壓、血管硬化及冠心病患者食之非常有益；金柑還可增強(qiáng)機(jī)體的抗寒能力，防治感冒[7-10]。目前，對于金柑的研究主要針對其民間藥膳、相關(guān)食品的研發(fā)和采后保鮮等方面，對其活性成分的研究還處于初步階段[11]。

多糖是金柑中的主要活性成分之一，目前，關(guān)于金柑多糖的提取及活性分析已有報(bào)道[12-14]，結(jié)果表明，金柑多糖對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和假單胞桿菌均有一定的抑制作用，且具有一定的清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的能力。熱水浸提法是提取多糖的傳統(tǒng)方法，但存在多糖得率低的問題，不利于后續(xù)對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的研究[15-17]。堿液浸提法能破壞細(xì)胞壁，從而使細(xì)胞中可溶性成分溶出，可顯著提高多糖的得率[18]。因此，本文以NaOH溶液為浸提劑，利用堿提醇沉法提取金柑多糖，考察液料比、提取時(shí)間、提取溫度、NaOH濃度和提取次數(shù)等5個(gè)單因素對金柑多糖得率影響的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對金柑多糖的最佳堿提工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為金柑多糖分離純化、結(jié)構(gòu)表征、功能學(xué)研究以及其綜合開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 尤溪金柑（九成熟）由尤溪縣農(nóng)業(yè)局提供；乙醇、石油醚等均為國產(chǎn)分析純試劑；本試驗(yàn)用水均為雙蒸水。

1.1.2 儀器與設(shè)備 RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；BCD-213KC型新飛冰箱：河南新飛電器有限公司；FZ102植物粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；AL104型精密分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；丹瑞HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠；L530型臺(tái)式低速離心機(jī)：長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Unic-UV-2000型紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；鹵素快速水分測定儀：深圳市冠亞電子科技有限公司；LG-1.0型真空冷凍干燥機(jī)：新陽速凍設(shè)備制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 金柑樣品的前處理 新鮮金柑→篩選→清洗→去核→切片→80 ℃干燥24 h→粉碎→過40目篩→金柑粉末（水分含量<3%）。

金柑樣品：取適量的金柑粉末，置于圓底燒瓶中，以1 ∶ 20比例加入石油醚，60 ℃回流浸提0.5 h，以脫去表面脂肪，紗布過濾；濾渣同樣以1 ∶ 20比例加入95%的乙醇，70 ℃回流1 h，以脫去大部分色素，風(fēng)干待用，即得到實(shí)驗(yàn)樣品。

1.2.2 金柑多糖的提取工藝流程 金柑樣品→堿液浸提→離心→上清液→減壓濃縮→醇析→離心→沉淀→凍干→測定。

1.2.3 多糖得率的測定

多糖得率=×100%

1.2.4 單因素試驗(yàn) 取10 g金柑粉末樣品，以金柑多糖得率為指標(biāo)，研究液料比（文中均為V/W）、提取時(shí)間、提取溫度、NaOH濃度和提取次數(shù)對多糖得率的影響。分別選取液料比為20 ∶ 1、25 ∶ 1、30 ∶ 1、35 ∶ 1、40 ∶ 1、45 ∶ 1、50 ∶ 1，提取時(shí)間1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h，提取溫度為50、60、70、80、90、100、110 ℃，NaOH濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 mol/L和提取次數(shù)為1、2、3、4、5次進(jìn)行單因素試驗(yàn)（平行試驗(yàn)3次）。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用五元二次回歸分析法研究金柑堿提過程中液料比、提取時(shí)間、提取溫度、NaOH濃度和提取次數(shù)與多糖得率的關(guān)系，并根據(jù)SAS 9.2軟件處理數(shù)據(jù)得二次回歸方程，采用響應(yīng)面分析法得到最佳工藝條件。

1.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面預(yù)測的最佳提取工藝參數(shù)，按照“1.2.3”的方法操作，測定實(shí)際得到的金柑多糖得率，以驗(yàn)證響應(yīng)面預(yù)測的準(zhǔn)確性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 9.2對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并對模型進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由單因素試驗(yàn)可知：液料比選擇35 ∶ 1、提取時(shí)間選擇2.5 h、提取溫度選擇80 ℃、NaOH濃度選擇0.04 mol/L和提取次數(shù)選擇3次為最佳條件。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以液料比（X1）、提取時(shí)間（X2）、提取溫度（X3）、NaOH濃度（X4）和提取次數(shù)（X5）為變量，以多糖得率（Y）為目標(biāo)函數(shù)，設(shè)計(jì)五元二次通用旋轉(zhuǎn)正交試驗(yàn)，各試驗(yàn)因素和水平見表1。

按五因子1/2實(shí)施安排試驗(yàn)， 變量參數(shù)P=5，星號(hào)臂值R=2，其中，試驗(yàn)的次數(shù)Mc=2P-1=16， 星號(hào)點(diǎn)試驗(yàn)次數(shù)Mr=2P=10， 中心點(diǎn)試驗(yàn)次數(shù)M0=10，因此，總試驗(yàn)點(diǎn)N=Mc+Mr+M0=16+10+10=36，即36個(gè)處理組合[19-20]。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

2.2 模型的建立及顯著性分析

采用SAS 9.2中的RSREG程序?qū)Ρ?的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，各因素經(jīng)回歸擬合后，得到多糖得率的五元二次方程如下：

Y=-43.666 2+0.355 1X1+1.210 4X2+0.708 7X3+320.854 2X4+2.056 0X5-0.006 2X1X1+0.062 2X2X1-0.524 6X2X2+0.001 3X3X1-0.001 9X3X2-0.004 1X3X3-3.187 5X4X1+13.875 0X4X2+0.131 3X4X3-3 023.958 3X4X4-0.008 4X5X1-0.171 3X5X2-0.012 7X5X3+14.187 5X5X4-0.101 1X5X5

該模型的方差分析結(jié)果見表3。

從表3可看出，回歸模型的P值小于0.000 1，表明該回歸模型極顯著；模型相關(guān)系數(shù)R2=0.972 1，變異系數(shù)CV=3.811 6，且失擬項(xiàng)不顯著，說明響應(yīng)值的變化有97.21%來源于所選變量，模型可以較好的解釋試驗(yàn)所得多糖得率的變化。因此，該回歸方程可以較好的描述各因素與金柑多糖得率之間的真實(shí)關(guān)系，可用于確定最佳提取工藝條件。一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的P值均小于0.000 1，說明一次項(xiàng)和二次項(xiàng)對多糖得率的影響極顯著，而交互項(xiàng)的P值大于0.05，所以交互項(xiàng)對多糖得率的影響不顯著。

各回歸系數(shù)方差分析結(jié)果見表4。由表4可知，各因素對多糖得率的影響程度從大到小依次排列為：提取溫度、NaOH濃度、提取次數(shù)、液料比和提取時(shí)間。在一次項(xiàng)中，X3和X4對金柑多糖得率的影響達(dá)到極顯著水平，X5對金柑多糖得率的影響達(dá)到顯著水平，而X1和X2對其影響不顯著；在二次項(xiàng)中，X1、X3和X4對金柑多糖得率的影響達(dá)到極顯著水平，X2和X5對其影響達(dá)到顯著水平；在交互項(xiàng)中，提取時(shí)間和液料比的交互作用（X2X1）、NaOH濃度和液料比的交互作用（X4X1）以及提取次數(shù)和NaOH濃度的交互作用（X5X4）對金柑多糖得率的影響達(dá)到顯著水平，其余交互項(xiàng)對其影響不顯著。

2.3 響應(yīng)面圖和等高線圖分析

由回歸模型方差分析結(jié)果（表4）可知，各因素對多糖得率的影響程度大小依次為：X3>X4>X5>X1>X2。X1、X2、X3、X4和X5二次項(xiàng)的系數(shù)均為負(fù)值，方程表示的拋物面開口向下有極大值點(diǎn)[21]。響應(yīng)面圖是響應(yīng)值對各試驗(yàn)因子構(gòu)成的三維空間的曲面圖。等高線圖為二維圖，它將具有相同的響應(yīng)值的所有點(diǎn)連接在一起，形成恒定響應(yīng)的等值線[22]。提取時(shí)間和液料比（X2X1）的交互作用、NaOH濃度和液料比（X4X1）的交互作用以及提取次數(shù)和NaOH濃度（X5X4）的交互作用對金柑多糖得率的影響顯著，交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖1～3。

由圖1可知，提取時(shí)間不變時(shí)，多糖得率隨液料比的增大而增加，但并非持續(xù)增加，當(dāng)液料比達(dá)37 ∶ 1～45 ∶ 1時(shí)多糖得率達(dá)到最大值，再繼續(xù)增大液料比，多糖得率反而開始下降，這是由于加水量過大稀釋了多糖，在一定體積倍數(shù)醇沉淀的過程中不利于多糖沉淀出來。由圖2～3可知，液料比和提取次數(shù)固定不變時(shí)，多糖得率隨NaOH濃度的增大而增加，但并非持續(xù)增加，當(dāng)NaOH濃度達(dá)0.04～0.058 mol/L時(shí)多糖得率達(dá)到最大值，再繼續(xù)增大NaOH濃度，多糖得率反而開始下降，這可能是由于堿濃度過高會(huì)使多糖發(fā)生脫酯和β-消去反應(yīng)，使多糖結(jié)構(gòu)受到破壞，多糖得率下降[18]。從圖1～3可知，各圖形的曲面較陡，直觀反映了各因素的交互作用對多糖得率的影響較顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。

2.4 金柑多糖堿提工藝的確定

結(jié)合回歸模型，由SAS 9.2軟件分析得到金柑多糖最佳的堿提工藝條件為：液料比40.875 4 ∶ 1，提取時(shí)間3.519 5 h，提取溫度88.641 9 ℃，NaOH濃度0.049 5 mol/L和提取次數(shù)3.403 5次，多糖得率為8.5683%。根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整的最佳提取條件為：液料比41 ∶ 1，提取時(shí)間3.5 h，提取溫度89 ℃，NaOH濃度0.05 mol/L和提取次數(shù)3次。在此條件下重復(fù)3次試驗(yàn)，金柑多糖得率分別為8.79%、8.34%、8.55%，平均值為（8.56±0.23）%，與理論預(yù)測值基本一致，說明回歸模型可靠。

2.5 與傳統(tǒng)熱水浸提法的對比

筆者之前的研究結(jié)果表明[12]，金柑多糖水提的最佳工藝條件為：液料比38 ∶ 1、溫度88 ℃、提取時(shí)間2.5 h、乙醇含量70%和提取3次，在此條件下，多糖得率為1.81%。在本研究所得最佳的堿提工藝條件下，多糖得率為8.56%，即比傳統(tǒng)熱水浸提法提高3.73倍。說明該方法操作簡單，多糖得率高，可有效地應(yīng)用于金柑多糖的提取。

3 討論與結(jié)論

在提取多糖的相關(guān)研究中，認(rèn)為堿提法有利于多糖的溶出，尤其是粘多糖[23]。金柑多糖較粘稠，適合采用堿提法提取。就多糖得率而言，堿提法要明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的熱水浸提法，但堿液可能對多糖的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)產(chǎn)生影響，而這兩方面都與多糖的生物學(xué)特性有著密切的聯(lián)系[24]。Ai等[25]的研究結(jié)果表明，堿提法和水提法得到的胖大海籽多糖的單糖組成和比例均一致，堿提法未對胖大海籽多糖的結(jié)構(gòu)造成影響；而Yi等[26]的研究結(jié)果表明，堿液使龍眼肉多糖的鏈構(gòu)象發(fā)生了改變，且提高了龍眼肉多糖的免疫活性。堿液是否會(huì)影響多糖的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)受到很多因素的影響，如堿濃度，提取時(shí)間和多糖結(jié)構(gòu)等。因此，堿提法是否會(huì)對金柑多糖的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物活性產(chǎn)生影響，需有待進(jìn)一步研究。

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