谷風林　董智哲　徐飛　趙建平

摘 要 利用固相微萃?。⊿PME）法萃取香草蘭中揮發(fā)和半揮發(fā)性的成分，再結(jié)合全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜（GC×GC/TOFMS）技術進行定性分析。試驗共鑒定出香草蘭中181種揮發(fā)、半揮發(fā)性化合物，其中含量較高的成分主要有香蘭素、呋喃甲醛、（2S，3S）-（+）-2，3-丁二醇、鄰甲氧基苯酚、2，3-丁二醇、苯酚、正己醛、（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇、對羥基苯甲醛、3-甲基丁酸、2，3，5，6-四甲基吡嗪、3-羥基-2-丁酮、香草酸、壬醛、正己酸、1-辛烯-3-酮。結(jié)果表明，GC×GC/TOFMS高分辨率和高靈敏度的特點非常適合復雜組分體系的定性分析。

關鍵詞 香草蘭；全二維氣相色譜；飛行時間質(zhì)譜

中圖分類號 TQ651 文獻標識碼 A

Analysis of Volatile and Semi-volatile Compounds in Vanilla Using

Solid Phase Micro-Extraction-Comprehensive Two

Dimensional Gas Chromatography/Time of

Flight Mass Spectrometry

GU Fenglin1，3， DONG Zhizhe2， XU Fei1，3， ZHAO Jianping1，3 *

1 Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural， Wanning， Hainan 571533， China

2 College of Food Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan， Hubei 430070， China

3 Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture， Wanning， Hainan

571533， China

Abstract Volatile and semi-volatile compounds in vanilla were extracted by using solid phase micro-extraction and were identified by comprehensive two-dimensional gas chromatography/time of flight mass spectrometer. A total of 181 volatile or semi-volatile compounds in vanilla were identified and compounds with high content were vanillin， 2-furancarboxaldehyde，[S-（R*，R*）]-2，3-butanediol， 2-methoxy-phenol， 2，3-butanediol， phenol， hexanal， [R-（R*，R*）]-2，3-butanediol， 4-hydroxy-benzaldehyde， 3-methyl-butanoic acid， tetramethyl-pyrazine， 3-hydroxy-2-butanone， 4-hydroxy-3-methoxy-benzoic acid， nonanal， hexanoic acid， 1-octen-3-one.The results showed that GC×GC/TOFMS with high resolution and sensitivity is suitable for the identification of complex system.

Key words Vanilla； Comprehensive two-dimensional gas chromatography； Time of flight mass spectrometer

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.031

香草蘭（Vanilla planifolia Andrews）是著名熱帶植物，原產(chǎn)于墨西哥，現(xiàn)已引種至中國、馬達加斯加、科摩羅、印度尼西亞、烏干達、印度等地區(qū)。香草蘭因其獨特的香味而聞名，作為增香劑廣泛用于食品、冰激凌、化妝品等行業(yè)[1-2]，因此其也被認為是最具經(jīng)濟價值的蘭科植物[3]。目前香草蘭香味成分的研究報道較多。Adedeji等[4]利用直接熱力解析法鑒定出香草蘭中61種成分；Perez-Silva[5]利用溶劑萃取法鑒定出墨西哥地區(qū)香草蘭中65種揮發(fā)性成分；Toth[6]對波旁、塔西提島、烏干達和印度尼西亞地區(qū)的香草蘭中進行鑒定比較；Brunschwig等[7]利用同時蒸餾萃取法萃取塔西提島香草蘭中96種揮發(fā)性成分。

前人采用不同的萃取方法對香草蘭中揮發(fā)性或半揮發(fā)性成分進行萃取，但定性方法均為氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）。全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜（GC×GC/TOFMS）能克服傳統(tǒng)單柱氣相色譜對多組分樣品分離能力相對較差的問題，具有分辨率高、靈敏度高等特點，在分析復雜體系樣品中的應用越來越廣泛[8-10]。

香草蘭揮發(fā)性成分具有組分多、難分離的特點，因此可借助GC×GC/TOFMS技術對香草蘭中揮發(fā)性成分進行分析，而目前暫未見相關報道，因此本研究在前期研究的基礎上將固相微萃取技術（SPME）與GC×GC/TOFMS技術相結(jié)合，對中國海南地區(qū)香草蘭中揮發(fā)性成分進行分析探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 香草蘭由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院香料飲料研究所提供

1.1.2 設備儀器 手動固相微萃取裝置、CAR/PDMS（75 μm）纖維頭（美國SUPELCO公司）；全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀由Agilent 6890N（美國安捷倫公司）和配備有Pegasus4D工作站的TOFMS（美國LECO公司）組成。

1.2 方法

1.2.1 固相微萃取 萃取條件參照董智哲等[11]報道的方法。

1.2.2 全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜分析 色譜柱：色譜柱1為Rxi-XLB， 30 m×0.25 mm×0.25 μm，色譜柱2為Rxi-200， 1.5 m×0.18 mm×0.2 μm；程序升溫：柱溫箱1為初始溫度50 ℃保持1 min，再以8 ℃/min 升溫至270 ℃保持10 min；柱溫箱2為初始溫度55 ℃保持1 min，再以8 ℃/min 升溫至275 ℃保持10 min。載氣：He（流速為1.0 mL/min）；進樣口溫度：250 ℃；調(diào)制器調(diào)制周期：5 s（熱吹時間1 s）；傳輸線溫度：270 ℃；電子轟擊電離源的電壓：70 eV；離子源溫度：220 ℃；檢測器電壓：1 600 V；數(shù)據(jù)采集頻率： 100 Hz；質(zhì)量數(shù)采集范圍： 45～550 amu；軟件將解卷積后得到的質(zhì)譜圖與標準Wiley譜庫和NIST譜庫進行匹配定性。

2 結(jié)果與分析

GC×GC由兩根色譜柱組成，通過改變固定相極性和柱溫可實現(xiàn)混合物在兩維色譜柱中的正交分離[12-13]。本研究中，第一根色譜柱極性較弱，第二根色譜柱極性較強，則色譜柱1中混合物根據(jù)其沸點由低到高依次流出，色譜柱2中混合物根據(jù)其極性強弱依次流出。

圖1和圖2是香草蘭中揮發(fā)、半揮發(fā)性組分GC×GC/TOFMS二維圖和三維圖，從圖中可看出，GC×GC/TOFMS分離的組分較多，并且多數(shù)組分都可以得到較好分離，顯示了GC×GC/TOFMS對復雜組分的較強分離能力。

利用全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜的方法共鑒定出香草蘭中181種揮發(fā)、半揮發(fā)性成分。表1中列出這些化合物的相關信息。這些成分中含量較高的成分有：香蘭素、呋喃甲醛、（2S，3S）-（+）-2，3-丁二醇、鄰甲氧基苯酚、2，3-丁二醇、苯酚、正己醛、（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇、對羥基苯甲醛、3-甲基丁酸、2，3，5，6-四甲基吡嗪、3-羥基-2-丁酮、香草酸、壬醛、正己酸、1-辛烯-3-酮等。

在此基礎上，根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同對香草蘭中鑒定出來的化合物進行分類，圖3和圖4列出了各類化合物個數(shù)和相對含量。從圖中看出香草蘭中芳香族化合物的種類最多而且相對含量最大，是香草蘭中最重要的一類香氣成分。其中含量最高的成分是香蘭素，它是香草蘭中整體香氣貢獻最大的香氣成分，對整體香氣的貢獻率高達1/3[14]。此外鄰甲氧基苯酚的含量也較高，也是香草蘭中重要香氣成分，Brunschwig[7]研究表明鄰甲氧基苯酚是塔西提島香草蘭中關鍵香氣成分之一。

在先前利用HS-SPME-GC-MS技術研究香草蘭中揮發(fā)性成分的相關報道中，醇類化合物含量并不占優(yōu)勢[11]，但本研究中醇類化合物的相對含量僅次于芳香族化合物，這可能是由分析儀器的差異所造成的，GC×GC/TOFMS相對于GC-MS而言能更好的分離組分，因此能鑒定出更多的醇類物質(zhì)。例如先前研究中利用GC-MS只能鑒定出2種2，3-丁二醇的同分異構(gòu)[11]，而本研究中利用GC×GC/TOFMS則能鑒定出3種2，3-丁二醇同分異構(gòu)體，而且這3種同分異構(gòu)體的含量均較高，共占總峰面積的18.9%。

香草蘭中醛類化合物個數(shù)為18種，相對總峰面積為7.5%，其含量與芳香族化合相比雖然較少，對香草蘭的香氣貢獻較大，主要呈巧克力、水果等令人愉快的香味[7，11]，如（E）-2-庚烯醛、反式-2-壬烯醛、辛醛等。Brunschwig等的研究表明塔西提島香草蘭中醛類化合物的香氣強度僅低于以芳香族化合物的香味[7]。本研究中醛類化合物中正己醛和壬醛的相對含量最高，分別為3.4%和1.5%，呈水果香和油脂味。

雜環(huán)類化合物的種類較多、相對含量較大。在已鑒定的雜環(huán)化合物中呋喃甲醛的相對含量最高，在所有化合物中僅次于香草醛，含量為10.2%，呈杏仁味。2，3，5，6-四甲基吡嗪的相對含量也較高約為1.8%，呈烘烤、堅果香味。此外，烷烴類物質(zhì)種類較多，僅次于芳香族化和雜環(huán)合物，但是其峰面積相對較小，香氣也強度較弱，對香草蘭整體香氣貢獻不大。

3 討論與結(jié)論

香草蘭的香氣成分十分復雜，產(chǎn)地不同，加工方法不同，香氣組成就差異明顯，文獻中香草蘭的香氣成分已檢出250多種，本實驗中通過全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜鑒定出181種，而以前的報道中一次實驗中最多檢出96種香氣成分[7]，由此可以看出，全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜適合用于香草蘭這類復雜化學成分體系中揮發(fā)性、半揮發(fā)性組分的研究分析，這主要是由于全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜高分辨率和高靈敏度的優(yōu)點。通過提取條件的優(yōu)化，香草蘭的未被檢出的微量香氣成分也可以通過全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜進行鑒定，從而為香草蘭風味指紋圖譜的構(gòu)建提供基礎。

與普通GCMS相比，全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜的分離部分是由兩根色譜柱組成，色譜柱間由調(diào)制器連接。調(diào)制器對第一根色譜柱中流出組分進行冷凝和聚焦并注入第二根色譜柱。這種冷凝聚焦作用一方面減小了第二維峰寬、提高了柱效，另一方面很大程度上增強了色譜峰的信噪比，使得一些痕量化合物在GC×GC上有較高的響應值[15]，因此對一些一維色譜上難以檢測的痕量成分有較高的靈敏度[12]。另外許多結(jié)構(gòu)相近的化合物如同分異構(gòu)體有相同或相似的沸點或極性，在一維色譜上極易出現(xiàn)“共餾峰”，導致難以分離鑒定。而GC×GC的瓦片和族分離效應使得GC×GC具有較高的分辨率，能分離對這類重疊峰有較好的分離效果[9]。

本研究中借助全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜技術的高分辨率和高靈敏度，再將其與固相微萃取技術相結(jié)合共鑒定出香草蘭中181種揮發(fā)、半揮發(fā)性成分，這些成分包含有芳香族、醛、醇、酮、酸、酯、雜環(huán)、烷烴等化合物，其中芳香族化合物在種類和含量方面均有顯著的優(yōu)勢，是香草蘭中最重要的一些成分。在已鑒定出來的成分中含量較高的物質(zhì)主要有香蘭素、呋喃甲醛、（2S，3S）-（+）-2，3-丁二醇、鄰甲氧基苯酚、2，3-丁二醇、苯酚、正己醛、（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇、對羥基苯甲醛、3-甲基丁酸、2，3，5，6-四甲基吡嗪、3-羥基-2-丁酮、香草酸、壬醛、正己酸、1-辛烯-3-酮等。

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