李 想，孫長海，姜文婷，房碧晗，王慧冰，方洪壯

(佳木斯大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

3種黃酮醇ESI-ITMS準(zhǔn)分子離子構(gòu)型的密度泛函理論分析

李 想，孫長海，姜文婷，房碧晗，王慧冰，方洪壯*

(佳木斯大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

采用密度泛函理論(Density functional theory，DFT) B3LYP方法，通過全幾何結(jié)構(gòu)優(yōu)化、二面角柔性勢能掃描，對山奈酚、槲皮素、楊梅素3種黃酮醇分子的優(yōu)勢構(gòu)象及電噴霧離子阱質(zhì)譜(ESI-ITMS)負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子的最優(yōu)構(gòu)型進行了研究，并從能量參數(shù)、構(gòu)型參數(shù)、質(zhì)譜實驗角度對準(zhǔn)分子離子的最優(yōu)構(gòu)型作出了確證。結(jié)果表明：山奈酚、槲皮素和楊梅素分子二面角D(1,2,1′,6′)均接近0°，分子的優(yōu)勢構(gòu)象均為B環(huán)與A,C環(huán)處在同一平面上的構(gòu)象；在負(fù)離子模式下，自動及手動掃描方式得到的山奈酚、槲皮素、楊梅素的二級質(zhì)譜的復(fù)雜程度依次減弱，各分子失去羥基氫所形成的準(zhǔn)分子離子結(jié)構(gòu)共軛鏈增長、共軛效應(yīng)加強；山奈酚存在兩種低能量的準(zhǔn)分子離子構(gòu)型，即失去B環(huán)4′位羥基氫與失去A環(huán)7位羥基氫的構(gòu)型，槲皮素與楊梅素失去B環(huán)4′位羥基氫的總能量最低、構(gòu)型最穩(wěn)定，且山奈酚、槲皮素、楊梅素準(zhǔn)分子離子構(gòu)型的穩(wěn)定性依次增加。該研究可供進一步探索黃酮醇類化合物ESI-ITMS負(fù)離子模式下的質(zhì)譜裂解規(guī)律參考。

黃酮醇化合物；電噴霧離子阱質(zhì)譜；密度泛函理論

黃酮醇(Flavonol)屬黃酮類化合物，廣泛分布于自然界，常以游離態(tài)或糖苷形式存在[1-3]，具有抗突變、抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老等多種藥理和保健作用，被廣泛用于藥品和保健食品的開發(fā)[4-6]。黃酮醇類化合物的天然產(chǎn)物及體內(nèi)樣品的分析[7-8]方法多采用電噴霧電離源質(zhì)譜技術(shù)。隨著軟電離質(zhì)譜的不斷發(fā)展，借助量子化學(xué)方法從分子水平研究化合物軟電離方式下的質(zhì)譜裂解規(guī)律受到廣泛關(guān)注[9-10]。在質(zhì)譜裂解規(guī)律的量子化學(xué)計算中，準(zhǔn)分子離子幾何結(jié)構(gòu)的可靠性直接影響后續(xù)深層次的分析，確定準(zhǔn)分子離子最有可能的最優(yōu)構(gòu)型是解析質(zhì)譜裂解機理的首要問題[11-12]。本研究運用量子化學(xué)計算方法，依據(jù)密度泛函理論(Density functional theory，DFT)，借助Gaussian 03計算軟件，考察了山奈酚、槲皮素、楊梅素3種黃酮醇分子處于穩(wěn)定狀態(tài)時的結(jié)構(gòu)特征，探索了各化合物分子的優(yōu)勢構(gòu)象以及電噴霧電離源負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子的最優(yōu)構(gòu)型，結(jié)合構(gòu)型參數(shù)與質(zhì)譜測定，對獲得的準(zhǔn)分子離子最優(yōu)構(gòu)型進行了確證。實驗結(jié)果可供深入探索ESI-ITMS負(fù)離子模式下黃酮醇類化合物的質(zhì)譜裂解機理參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AgilentG6310電噴霧離子阱質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司)；KDS 100 CE微量注射泵(Agilent kd scientific)。對照品：山奈酚(Kaempferol，純度>98%，批號20121215，大連美侖生物技術(shù)有限公司)；槲皮素(Quercetin，純度>98%，批號1109630，天津一方科技有限公司)；楊梅素(Myricetin，純度≥98%，批號13020102，成都曼斯特生物科技有限公司)。甲醇、異丙醇(色譜級，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI源；掃描方式：負(fù)離子模式下自動一級質(zhì)譜全掃描及手動二級質(zhì)譜提取離子掃描；碎裂電壓：自動1.00 V，手動0.10～1.50 V；掃描范圍：m/z50～330；鞘氣和輔助氣：氮氣；鞘氣流速10 L·min-1；輔助氣流速：0.15 L·min-1；碰撞氣：氦氣；噴霧電壓：3.5 kV；毛細(xì)管電壓：13 V；干燥氣溫度：325 ℃；微量注射泵進樣流速：0.5 mL·h-1；進樣方式：直接進樣。對照品濃度：5 μg/mL；溶劑：甲醇。

1.3 量子化學(xué)計算

量子化學(xué)計算采用Gaussian 03軟件完成。各化合物分子及離子的初始幾何結(jié)構(gòu)由軟件GaussView 3.0給出。首先，采用密度泛函理論B3LYP/6-31+g(2d,2p)方法，對分子初始結(jié)構(gòu)中B環(huán)與C環(huán)間的二面角進行旋轉(zhuǎn)360°柔性勢能掃描，獲得各分子能量最低的構(gòu)象；再用B3LYP/6-31g(d)方法對獲得的構(gòu)象進行優(yōu)化，得到各分子的優(yōu)勢構(gòu)象及相關(guān)參數(shù)。在優(yōu)勢構(gòu)象基礎(chǔ)上，采用相同優(yōu)化方法對各分子可能的準(zhǔn)分子離子構(gòu)型進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化及振動分析，并在RB3LYP/6-31+g(2d,2p)水平計算各個優(yōu)化結(jié)構(gòu)的能量；最后，通過能量比較分析，得出各化合物準(zhǔn)分子離子的最優(yōu)構(gòu)型。結(jié)構(gòu)優(yōu)化及振動分析收斂標(biāo)準(zhǔn)均為：力的最大值(Maximum Force)小于0.000 450；力的均方根(RMS Force)小于0.000 300；位移的最大值(Maximum Displacement)小于0.001 800；位移的均方根(RMS Displacement)小于0.001 200。鍵長、偶極矩等參數(shù)從各分子及準(zhǔn)分子離子相應(yīng)的優(yōu)化結(jié)果文件中獲取。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子優(yōu)勢構(gòu)象

黃酮醇化合物分子的初始結(jié)構(gòu)及原子位次編號如圖1所示，其中，山奈酚：R1=H，R2=H；槲皮素：R1=OH，R2=H；楊梅素：R1=OH，R2=OH。分子柔性勢能掃描各角度構(gòu)象與最穩(wěn)定構(gòu)象的能量差結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)分子處于最穩(wěn)定狀態(tài)即能量最低時，山奈酚、槲皮素和楊梅素的二面角D(1,2,1′,6′)均接近0°。各分子能量最低結(jié)構(gòu)的優(yōu)化結(jié)果均符合收斂標(biāo)準(zhǔn)，振動分析未出現(xiàn)虛頻，各構(gòu)象穩(wěn)定。各分子的優(yōu)勢構(gòu)象如圖3所示。3種化合物優(yōu)勢構(gòu)象的部分二面角參數(shù)見表1。表1數(shù)據(jù)表明，當(dāng)分子構(gòu)型相對最穩(wěn)定時，A，C，B環(huán)處于同一平面，與文獻[13-14]報道相吻合。

圖1 3種化合物的分子結(jié)構(gòu)

圖2 3種化合物二面角D(1,2,1′,6′)的柔性勢能掃描曲線

圖3 3種化合物的優(yōu)勢構(gòu)象

表1 3種化合物優(yōu)勢構(gòu)象的部分二面角參數(shù)

Table 1 Some dihedral parameters of the preferred conformations of three compounds

Dihedral(二面角)Degree(角度，°)Kaempferol(山奈酚)Quercetin(槲皮素)Myricetin(楊梅素)D1(5，10，9，1)-180 0000180 0014180 0001D2(4，10，9，8)179 9996-180 0051179 9997D3(5，10，4，3)180 0001-180 0041179 9986D4(8，9，1，2)-179 9998180 0045-179 9980D5(3，2，1′，6′)0 0196-0 0015-0 0160D6(1，2，1′，2′)0 01460 0000-0 0159D7(3，2，1′，2′)180 0183179 9977179 9847D8(1，2，1′，6′)0 0146180 0008179 9834

分子初始結(jié)構(gòu)的輸入方法會影響優(yōu)勢構(gòu)象的結(jié)果。當(dāng)采用ChemDraw Ultra8.0及Chem3D Ultra8.0方法時，優(yōu)化后山奈酚、槲皮素和楊梅素的分子B環(huán)與A，C環(huán)的二面角分別為36.5°，36.1°和36.4°；而通過GaussView3.0輸入，對二面角D(1,2,1′,6′)進行柔性勢能掃描，得到各分子優(yōu)勢構(gòu)象所對應(yīng)的B環(huán)與A，C環(huán)的二面角卻均接近0°。由于柔性勢能掃描能夠獲得D(1,2,1′,6′)旋轉(zhuǎn)1周的各個角度的能量值，可通過能量的比較來確定分子的優(yōu)勢構(gòu)象，相對更加全面合理，因此本研究采用GaussView3.0輸入。需指出，雖然兩種輸入方式產(chǎn)生的優(yōu)勢構(gòu)象結(jié)果不同，但相應(yīng)的優(yōu)勢構(gòu)象間的能量差別較小，在室溫及空間位阻很小的情況下，非平面構(gòu)象只需克服很小的能壘即可依靠分子熱運動所提供的能量轉(zhuǎn)化成平面構(gòu)象[15]。

2.2 準(zhǔn)分子離子結(jié)構(gòu)

2.2.1 能量分析 在電噴霧電離源負(fù)離子模式下，羥基氫較苯環(huán)氫更易丟失而發(fā)生去質(zhì)子化。山奈酚、槲皮素、楊梅素分子中分別具有4，5，6個羥基，可分別失去質(zhì)子而形成準(zhǔn)分子離子([M-H]-)。3種化合物可能的[M-H]-構(gòu)型的結(jié)構(gòu)優(yōu)化、振動分析及能量計算表明：優(yōu)化均符合收斂標(biāo)準(zhǔn)，振動分析無虛頻，構(gòu)型穩(wěn)定。表2為3種黃酮醇可能的[M-H]-體系的能量計算結(jié)果，可知山奈酚、槲皮素與楊梅素丟失B環(huán)04′-H(即4′位羥基氫，下同)的體系總能量均最低，構(gòu)型最穩(wěn)定，所形成[M-H]-為熱力學(xué)擇優(yōu)結(jié)果。

與此同時，由于山奈酚丟失A環(huán)07-H(即7位羥基氫，下同)與丟失B環(huán)04′-H所形成的兩種[M-H]-總能量接近，故在負(fù)離子模式下，山奈酚存在兩種不同的[M-H]-構(gòu)型，分別記作山奈酚Ⅰ(Kaempferol Ⅰ，丟失04′-H)與山奈酚Ⅱ(Kaempferol Ⅱ，丟失07-H)。

表2 3種化合物可能的[M-H]-構(gòu)型的能量

圖4 3種化合物丟失04′-H的[M-H]-立體構(gòu)型及可能的氫鍵(?)

2.2.3 質(zhì)譜分析 3種黃酮醇的自動二級質(zhì)譜圖如圖5所示。由圖5可知，山奈酚、槲皮素、楊梅素二級質(zhì)譜的復(fù)雜程度逐漸降低。對各準(zhǔn)分子離子施以不同碎裂電壓，手動提取二級質(zhì)譜時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)碎裂電壓較低時，山奈酚即可獲得多個產(chǎn)物離子，槲皮素只產(chǎn)生兩個明顯的離子(m/z178.8與m/z150.8)，而楊梅素僅有一個明顯的m/z178.8離子。由于二級質(zhì)譜所呈現(xiàn)的復(fù)雜程度是隨著化合物準(zhǔn)分子離子穩(wěn)定性的升高而降低，因此可以說明山奈酚、槲皮素、楊梅素準(zhǔn)分子離子的穩(wěn)定性逐漸增加。

圖5 3種化合物[M-H]- 的MS2質(zhì)譜圖

3種黃酮醇的[M-H]-穩(wěn)定構(gòu)型的相應(yīng)偶極矩計算結(jié)果為：山奈酚(Ⅰ)11.697 4D、山奈酚(Ⅱ)13.230 9D、槲皮素10.058 1D、楊梅素9.022 5D。結(jié)合質(zhì)譜測定結(jié)果及相關(guān)文獻資料分析可推斷出，對于[M-H]-最為穩(wěn)定的楊梅素，由于分子C環(huán)極性相對較小，使得二級質(zhì)譜主要發(fā)生C環(huán)跨環(huán)開裂產(chǎn)生1,2A-m/z178.8離子，進而脫去中性分子CO生成m/z150.8離子及連續(xù)脫去CO 和CO2后的m/z106.9離子[16]。槲皮素[M-H]-的極性相對于楊梅素有所下降，在C環(huán)跨環(huán)開裂產(chǎn)生m/z178.8，150.8，106.9離子的同時，也發(fā)生C環(huán)的另一跨環(huán)開裂，產(chǎn)生1,3A-m/z150.8離子[16-17]，使得m/z150.8處的強度增大；與此同時，C環(huán)同環(huán)開裂的程度增加，有多個脫去中性低質(zhì)量碎片后的離子產(chǎn)生。山奈酚[M-H]-極性相對較大，其穩(wěn)定性較差，故其二級質(zhì)譜無1,2A-m/z178.8離子產(chǎn)生，而在產(chǎn)生1,3A-m/z150.8離子的同時，還產(chǎn)生另一跨環(huán)開裂的0,2A-m/z162.8離子及其連續(xù)碎裂后的m/z106.9離子，并且C環(huán)同環(huán)開裂的比例加大，產(chǎn)生大量脫去中性碎片的離子[18-20]。

3種黃酮醇[M-H]-體系的C環(huán)各鍵鍵長及C環(huán)與B環(huán)相接的鍵長見表3。由表3可知，構(gòu)成C環(huán)的C—C鍵與C—O鍵及連接C環(huán)與B環(huán)的C—C鍵的長度介于單鍵與雙鍵之間，說明組成C環(huán)的各原子間及C環(huán)與B環(huán)間存在著共軛現(xiàn)象。由表3還知，在3種黃酮醇[M-H]-所涉及的化學(xué)鍵中，山奈酚、槲皮素、楊梅素多數(shù)鍵鍵長的順序是由長到短。由于鍵長越長，鍵越易斷裂，從而可進一步解釋3種黃酮醇質(zhì)譜復(fù)雜的順序。結(jié)合3種黃酮醇的二級質(zhì)譜可知，由于C環(huán)的各鍵中，C2—C3及C4—C10鍵的鍵長數(shù)值最大，其中又以山奈酚為最大，因此山奈酚[M-H]-最易發(fā)生C2—C3及C4—C10斷裂，在質(zhì)譜中表現(xiàn)為，先脫去中性分子CO生成m/z257.0離子，進而再分別脫去H2O與CO生成m/z239.0與m/z228.9的離子，m/z228.9離子可繼續(xù)脫去CO2生成m/z184.9的離子。另外，山奈酚C4—C10的斷裂，也可導(dǎo)致C2H2O的脫去，產(chǎn)生m/z243.1離子，進而脫去CO2生成m/z199.0的離子；同時C4—C10的斷裂還會引發(fā)m/z142.9離子的產(chǎn)生。由表3還可知，3種黃酮醇[M-H]-連接C環(huán)與B環(huán)的C2—C1′鍵較長、較易斷裂，表現(xiàn)在圖5的二級質(zhì)譜上，山奈酚脫去中性碎片AC環(huán)，產(chǎn)生m/z93.0的酚羥基離子[21]，而槲皮素和楊梅素[M-H]-脫去中性碎片B環(huán)，產(chǎn)生m/z192.8的離子[16]。雖然m/z192.8的離子峰強度較低，但此峰的強度與槲皮素和楊梅素[M-H]-的鍵長順序相對應(yīng)。關(guān)于山奈酚與另外兩種黃酮醇在C2—C1′鍵開裂時生成不同產(chǎn)物離子的現(xiàn)象，推測其原因為，山奈酚[M-H]-構(gòu)型Ⅱ的C2—C1′鍵鍵長大于構(gòu)型Ⅰ，鍵斷裂發(fā)生在構(gòu)型Ⅱ上，鍵斷裂時電荷轉(zhuǎn)移的機制與丟失04′-H構(gòu)型的槲皮素和楊梅素的[M-H]-有所不同。

表3 3種化合物[M-H]-C環(huán)的主要鍵長(?)

3 結(jié) 論

依據(jù)密度泛函理論，通過量子化學(xué)計算確定山奈酚、槲皮素、楊梅素化合物分子的優(yōu)勢構(gòu)象為A，C，B環(huán)處在同一平面，為平面共軛體系。量子化學(xué)與質(zhì)譜實驗的結(jié)合分析表明，電噴霧離子阱質(zhì)譜負(fù)離子模式下，3種黃酮醇分子中B環(huán)4′-OH脫去質(zhì)子及山奈酚A環(huán)7-OH脫去質(zhì)子所形成的準(zhǔn)分子離子體系，使共軛系統(tǒng)共軛鏈增長，共軛效應(yīng)加強，總能量最低，均為準(zhǔn)分子離子的最優(yōu)構(gòu)型。

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Analysis on ESI-ITMS Quasi-molecular Ion Configurations of Three Flavonol Compounds by Density Functional Theory

LI Xiang,SUN Chang-hai,JIANG Wen-ting,FANG Bi-han,WANG Hui-bing,FANG Hong-zhuang*

(Pharmaceutical College，Jiamusi University,Jiamusi 154007,China)

Using density functional theory(DFT) B3LYP method,the preferred molecular conformations and the optimal configurations of kaempferol,quercetin and myricetin quasi-molecular ions in electrospray ion trap mass spectrometry(ESI-ITMS) negative ion mode were studied by the full geometry optimization and the relaxed dihedral potential energy scan.The optimal configurations of three flavonol quasi-molecular ions were confirmed in the aspects of energy parameters,configuration parameters,and mass spectrometry experiments.The results indicated that the degrees of dihedral D(1,2,1′,6′) for kaempferol,quercetin and myricetin were close to 0°,and the preferred conformations of three flavonol compounds were respectively coplanar including A,C and B ring.In the negative ion mode,the complexities of MS2spectra which were determined by the automatic and manual methods for kaempferol,quercetin and myricetin were successively weakened.The optimal configurations of quasi-molecular ions were the structures lost the hydrogen of phenolic hydroxyl,with the conjugated chain increasing and the conjugated effect strengthening.Two quasi-molecular ion configurations for kaempferol existed,that were loss of 4′-OH hydrogen and 7-OH hydrogen,and the total energy of loss of 4′-OH hydrogen configurations for quercetin and myricetin were the lowest and the most stable.The stabilities of quasi-molecular ion configurations for kaempferol,quercetin and myricetin were increased successively.The analysis of the study can be used as a reference for further exploration of the fragmentation pathway and mechanism of flavonol compounds in ESI-ITMS negative ion mode.

flavonol compounds; electrospray ionization ion trap mass spectrometry(ESI-MS); density functional theory

2014-10-11；

2014-11-10

佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項目(LZR2014_032)；黑龍江省自然科學(xué)基金資助項目(D201226)

10.3969/j.issn.1004-4957.2015.02.004

O657.63；TQ460.72

A

1004-4957(2015)02-0147-06

*通訊作者：方洪壯，教授，研究方向：中藥分析與計算藥物分析，Tel：0454-8611265，E-mail：fhz-chjms@sohu.com