張曉蕾， 孫如寧， 楊小弟

(1.中國(guó)藥科大學(xué) 高等職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 211198；2.南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210097)

石墨烯量子點(diǎn)印跡傳感器檢測(cè)鹽酸羅哌卡因

張曉蕾1， 孫如寧1， 楊小弟2*

(1.中國(guó)藥科大學(xué) 高等職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 211198；2.南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210097)

采用熱聚合法合成石墨烯量子點(diǎn)，再將石墨烯量子點(diǎn)通過(guò)π-π作用吸附在聚鄰氨基苯酚膜表面，基于石墨烯量子點(diǎn)表面電化學(xué)印跡，制備石墨烯量子點(diǎn)-分子印跡傳感器檢測(cè)鹽酸羅哌卡因。同時(shí)采用原子力顯微鏡表征石墨烯量子點(diǎn)尺寸，示差脈沖伏安法研究印跡響應(yīng)機(jī)理。安培I～t曲線法發(fā)現(xiàn)傳感器對(duì)鹽酸羅哌卡因的響應(yīng)線性范圍為2.0×10-6～6.1×10-4mol/L，檢出限(S/N=3)為1.1×10-6mol/L，與未使用石墨烯量子點(diǎn)的分子印跡傳感器對(duì)比，石墨烯量子點(diǎn)-分子印跡傳感器的線性范圍變寬，檢出限降低，空白加標(biāo)回收率為91.0%～101%。將傳感器用于血漿樣品中鹽酸羅哌卡因的檢測(cè)，測(cè)得其濃度為4.21×10-6mol/L，高效液相色譜法驗(yàn)證顯示該方法的檢測(cè)結(jié)果可靠，可用于臨床樣品的檢測(cè)。

石墨烯量子點(diǎn)；分子印跡；鹽酸羅哌卡因；鄰氨基苯酚

圖1 鹽酸羅哌卡因的分子結(jié)構(gòu)

羅哌卡因(Ropivacaine，RP)是瑞典Astra制藥公司研發(fā)的新型長(zhǎng)效酰胺類(lèi)局麻藥，主要用于外科麻醉和硬膜外阻滯麻醉，可用于各種手術(shù)，以及手術(shù)后或分娩后急性止痛[1]。麻醉劑用量直接影響麻醉作用效果，麻醉劑過(guò)量更有可能導(dǎo)致死亡，因此臨床常用注射劑鹽酸羅哌卡因(Ropivacaine hydrochloride,RH)(見(jiàn)圖1)含量的準(zhǔn)確檢測(cè)，對(duì)有效控制麻醉劑用量具有重要意義。目前檢測(cè)羅哌卡因的主要方法有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法等[2-4]。這些方法相對(duì)復(fù)雜，使用設(shè)備昂貴，而電化學(xué)法比較簡(jiǎn)便,且目前使用電化學(xué)法檢測(cè)鹽酸羅哌卡因的研究尚無(wú)報(bào)道。

分子印跡是一種合成對(duì)某一特定分子(印跡分子)具有選擇性的聚合物的方法[5-6]。分子印跡聚合物內(nèi)部具有固定大小和形狀的孔穴，并具有確定排列的功能基團(tuán)，其對(duì)模板分子的立體結(jié)構(gòu)具有記憶功能。石墨烯量子點(diǎn)是尺寸小于100 nm的石墨烯片[7]，其顯著的量子限域和邊緣效應(yīng)，使之呈現(xiàn)出多種新的物理和化學(xué)性質(zhì)[8-9]，可用于傳感器研制[10-11]。石墨烯量子點(diǎn)具有良好的電子遷移速率和化學(xué)穩(wěn)定性，有望成為電化學(xué)傳感器的理想電極材料[12-14]。本研究以鹽酸羅哌卡因?yàn)槟０宸肿?，鄰氨基苯酚為功能單體，使用分子印跡技術(shù)在石墨烯量子點(diǎn)表面電化學(xué)聚合印跡修飾玻碳電極制備傳感器(GQDs-MIP/GCE)，并將其用于鹽酸羅哌卡因的檢測(cè)。該方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)線性范圍寬、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，為臨床樣本中鹽酸羅哌卡因的檢測(cè)提供了一種新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI830C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；VNS5型原子力顯微鏡(美國(guó)Veeco公司)，Agilent Technologies 1260 高效液相色譜儀(Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，Agilent 1260DAD檢測(cè)器)。

鹽酸羅哌卡因(RH,純度>99%，中國(guó)藥科大學(xué)藥劑實(shí)驗(yàn)室)；檸檬酸(純度>99.5%)、鄰氨基苯酚(OAP)、抗壞血酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；鹽酸多巴胺(98%，阿拉丁試劑)；苯丙氨酸、色氨酸(上?；菖d生化試劑有限公司)；血漿樣品(中國(guó)藥科大學(xué)藥劑實(shí)驗(yàn)室)；甲醇(色譜純，美國(guó)Tedia公司)；其余均為分析純?cè)噭?，?shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 石墨烯量子點(diǎn)的合成 石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)的合成使用 “從下至上”的方法[15]。稱(chēng)取2 g檸檬酸置于20 mL燒杯中，在控溫電熱套中加熱至200 ℃，保持恒溫，在5 min內(nèi)檸檬酸融化成無(wú)色液體再轉(zhuǎn)變成淡黃色，在30 min內(nèi)變成橙色時(shí)得到石墨烯量子點(diǎn)，加入10 mL水充分?jǐn)嚢?0 min得到石墨烯量子點(diǎn)貯備液，置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 石墨烯量子點(diǎn)印跡電極的制備 玻碳電極依次用1.0，0.3，0.05 μm的氧化鋁粉拋光，在水和無(wú)水乙醇中分別超聲洗滌5 min，并重復(fù)3次，進(jìn)行電化學(xué)拋光處理，在0.5 mol/L的H2SO4中于-0.3～1.5 V進(jìn)行循環(huán)伏安電化學(xué)處理，直至獲得穩(wěn)定的循環(huán)伏安響應(yīng)。

圖2 GQDs-MIP/GCE電極制備過(guò)程示意圖

如圖2所示，電化學(xué)聚合在含有50 mmol/L 鄰氨基苯酚(OAP)的1 mol/L H2SO4和0.5 mol/L NaSO4溶液中進(jìn)行，用循環(huán)伏安法掃描10次，掃描范圍-0.2～0.8 V，掃描速率100 mV/s，在玻碳電極表面形成導(dǎo)電聚合膜，得聚鄰氨基苯酚膜修飾電極。

取1 mL 0.2 g/mL GQDs貯備液稀釋10倍，將聚鄰氨基苯酚膜(POAP)修飾電極浸入稀釋后的GQDs溶液中6 h，待GQDs充分吸附于膜表面后取出，用水清洗電極表面得POAP-GQDs修飾電極。

在0.2 mol/L NaCl介質(zhì)中，以5 mmol/L RH為模板分子，25 mmol/L 鄰氨基苯酚為功能單體，在GQDs表面采用“致孔劑印跡技術(shù)”[16-17]電化學(xué)印跡聚合，循環(huán)伏安法掃描30次，掃描范圍-0.2～1.2 V，掃描速率50 mV/s，使印跡聚合膜沉積在電極表面，再用0.5 mol/L的H2SO4溶液洗滌12 h，除去聚合物基質(zhì)中的RH，制成保留有模板分子構(gòu)型孔穴的石墨烯量子點(diǎn)印跡(GQDs-MIP/GCE)電極。

1.2.3 石墨烯量子點(diǎn)無(wú)印跡電極的制備 實(shí)驗(yàn)步驟與“1.2.2”同，在印跡聚合液中不加入模板分子RH，即制得石墨烯量子點(diǎn)無(wú)印跡(GQDs-NIP/GCE)電極。

1.2.4 未摻雜石墨烯量子點(diǎn)印跡電極的制備 除電極不浸入GQDs溶液中，其它實(shí)驗(yàn)步驟與“1.2.2”相同，即制得無(wú)石墨烯量子點(diǎn)印跡(MIP/GCE)電極。

1.3 電化學(xué)測(cè)量

電化學(xué)測(cè)量在傳統(tǒng)三電極電化學(xué)池中進(jìn)行，分別以GCE，GQDs-MIP/GCE，GQDs-NIP/GCE，MIP/GCE電極為工作電極，鉑絲電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極。采用循環(huán)伏安法表征電極表面的修飾膜，支持電解質(zhì)為含有0.1 mol/L KNO3的5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6(1∶1)溶液，電位掃描范圍-0.1～0.6 V，掃描速率50 mV/s。用示差脈沖伏安法表征電極印跡效應(yīng)，掃描速率為20 mV/s，脈沖振幅為50 mV，脈沖寬度為50 ms，安培I～t曲線法研究電極性能，電解質(zhì)溶液均為含有0.1 mol/L KNO3的5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1∶1)的PBS緩沖溶液(pH 7.4)。

1.4 血漿樣品處理

將血漿樣品離心，取上層清液與甲醇按照體積比1∶3充分混合，在5 ℃以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心分離7 min后，取上層清液定容。

圖3 GQDs 的原子力顯微鏡圖

1.5 高效液相色譜條件

流動(dòng)相為甲醇-水(40∶60)，加入磷酸二氫鉀調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值至3.8，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，柱壓182 bar。

圖4 4種電極在含0.1 mol/L KNO3的5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-(1∶1)溶液中的循環(huán)伏安圖

圖5 酸性介質(zhì)中聚鄰氨基苯酚膜的結(jié)構(gòu)

2 結(jié)果與討論

2.1 原子力顯微鏡表征GQDs

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檸檬酸分子的熱聚合生成石墨烯量子點(diǎn)。如圖3所示，所制得GQDs粒徑控制在20 nm左右，與文獻(xiàn)[15]一致。

2.2 修飾電極的電化學(xué)表征

采用循環(huán)伏安法表征電極膜的導(dǎo)電性能。圖4為4種不同電極在含0.1 mol/L KNO3的5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-(1∶1)溶液中的循環(huán)伏安圖。圖4a是裸玻碳電極表面[Fe(CN)6]3-/4-離子氧化還原反應(yīng)的循環(huán)伏安曲線，鄰氨基苯酚在H2SO4酸性介質(zhì)(pH<3.0)中電聚合成均勻的導(dǎo)電聚鄰氨基苯酚膜(膜結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5)[18]，[Fe(CN)6]3-/4-離子在聚鄰氨基苯酚膜(POAP)修飾電極表面的循環(huán)伏安曲線見(jiàn)圖4b。石墨烯量子點(diǎn)由于π-π堆積作用吸附在聚鄰氨基苯酚膜表面，因石墨烯量子點(diǎn)具有優(yōu)良的電子遷移速率，可以觀察到電極表面循環(huán)伏安曲線的氧化還原電流增強(qiáng)(圖4c)，說(shuō)明電極在吸附石墨烯量子點(diǎn)后，其導(dǎo)電性能增強(qiáng)。然而在中性NaCl介質(zhì)中，分子印跡溶液中的功能單體鄰氨基苯酚電聚合成均勻的非導(dǎo)電性聚合膜，則電極表面循環(huán)伏安曲線的氧化還原電流明顯減弱(圖4d)。

圖6 GQDs-MIP/GCE(a,b)與GQDs-NIP/GCE(c,d) 電極對(duì)RH響應(yīng)的示差脈沖伏安圖

2.3 傳感器印跡效應(yīng)

未加模板分子的GQDs-NIP/GCE電極經(jīng)0.5 mol/L H2SO4洗脫后，在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的示差脈沖伏安曲線(見(jiàn)圖6c)無(wú)明顯的峰電流。再加入0.04 mmol/L RH后，仍未觀察到顯著的峰電流(圖6d)，由此可以證明未印跡電極對(duì)RH無(wú)響應(yīng)。

2.4 檢測(cè)溶液pH值的影響

因RH的pKa為8.1，在堿性較強(qiáng)溶液中易發(fā)生沉淀，而溶液酸性較強(qiáng)可能會(huì)阻礙RH分子進(jìn)入空穴形成氫鍵。實(shí)驗(yàn)考察了檢測(cè)溶液pH值在5.8～7.6范圍內(nèi)時(shí)傳感器對(duì)0.01 mmol/L RH的響應(yīng)。溶液pH值從5.8增加到7.3時(shí)，傳感器響應(yīng)電流逐漸增大，在7.3～7.5之間，傳感器響應(yīng)電流值達(dá)到最大，而從pH 7.5繼續(xù)增加到pH 7.6時(shí)，響應(yīng)電流值開(kāi)始降低，繼續(xù)增大溶液pH值，RH開(kāi)始沉淀，無(wú)法再檢測(cè)。同時(shí)考慮到人體血液pH值在7.35～7.45之間，故選擇pH 7.4的PBS緩沖溶液為檢測(cè)底液。

圖7 GQDs-MIP/GCE(a) 與MIP/GCE 電極(b) 對(duì)RH的響應(yīng)曲線

2.5 傳感器線性范圍及檢出限

在pH 7.4的PBS緩沖溶液中，應(yīng)用安培I～t曲線法測(cè)定GQDs-MIP/GCE和MIP/GCE電極對(duì)不同濃度RH的響應(yīng)(如圖7所示)。對(duì)比其響應(yīng)曲線，結(jié)果顯示，加入GQDs后增強(qiáng)了電子傳導(dǎo)速率以及電極表面對(duì)檢測(cè)物的富集，使得GQDs-MIP/GCE的電極響應(yīng)信號(hào)更靈敏，線性范圍更寬。RH濃度在2.0×10-6～6.1×10-4mol/L范圍內(nèi)與電流變量有良好線性關(guān)系(圖7插圖)，線性方程為ΔI(μA)=0.803 2c(mmol/L)-0.504 0(r2=0.993 1)，檢出限(S/N=3)為1.1×10-6mol/L。

2.6 傳感器的重現(xiàn)性、抗干擾性及穩(wěn)定性

在相同實(shí)驗(yàn)條件下，用同1支GQDs-MIP/GCE電極對(duì)0.01 mmol/L RH平行測(cè)定6次，響應(yīng)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.3%；用相同方法修飾6支電極，并分別測(cè)定0.01 mmol/L RH，其RSD為2.4%。

實(shí)驗(yàn)還考察了血液中部分生物分子和常見(jiàn)無(wú)機(jī)鹽離子對(duì)傳感器檢測(cè)RH的干擾情況。相同實(shí)驗(yàn)條件下，濃度均為0.01 mmol/L的鹽酸多巴胺、抗壞血酸、苯丙氨酸、色氨酸、葡萄糖以及無(wú)機(jī)磷、Na+， Mg2+，K+，Ca2+，Cl-離子均無(wú)干擾(RSD<5%)。結(jié)果表明，此方法的抗干擾性較好。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究，使用過(guò)的電極用0.5 mol/L H2SO4洗滌10 min即可使電極基本恢復(fù)至響應(yīng)前的狀態(tài)，并可得到重現(xiàn)的響應(yīng)值。將電極放在4 ℃冰箱保存7 d后，其對(duì)RH的響應(yīng)值仍保持在初始值的90.1%。以上結(jié)果表明傳感器具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

2.7 空白加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在0.1 mol/L KNO3的5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1∶1)PBS緩沖溶液(pH 7.4)中，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定RH的回收率，結(jié)果如表1所示。空白加標(biāo)回收率為91.0%～101%，RSD為1.3%～2.1%，此結(jié)果說(shuō)明空白基質(zhì)干擾較小，該方法準(zhǔn)確度較好。

表1 空白加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.8 實(shí)際樣品的檢測(cè)

為考察方法實(shí)用性，將傳感器用于血漿樣品中RH的檢測(cè)，測(cè)得樣品中RH濃度為4.21×10-6mol/L，RSD(n=6)為3.1%。同時(shí)采用高效液相色譜法檢測(cè)相同血漿樣品，測(cè)得樣品中RH濃度為3.99×10-6mol/L，RSD(n=6)為2.9%。由此可以證明應(yīng)用電化學(xué)方法測(cè)量的可行性。

3 結(jié) 論

本文將石墨烯量子點(diǎn)材料與分子印跡技術(shù)結(jié)合，研制了檢測(cè)RH的GQDs-MIP/GCE電化學(xué)傳感器。該傳感器具有制備簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、線性范圍寬，選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定好等優(yōu)點(diǎn)，有望用于臨床樣本中RH含量的檢測(cè)。

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Determination of Ropivacaine Hydrochloride with Graphene Quantum Dots-Molecularly Imprinted Polymer Electrochemical Sensor

ZHANG Xiao-lei1，SUN Ru-ning1，YANG Xiao-di2*

(1.Higher Vocational College，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198,China；2.College of Chemistry and Materials Science，Nanjing Normal University，Nanjing 210097,China)

A novel electrochemical sensor for ropivacaine hydrochloride(RH) based on graphene quantum dots-molecularly imprinted polymer(MIP) modified glass carbon electrode was constructed.The graphene quantum dots(GQDs) were synthesized by the pyrolysis method,and adsorbed on the surface of conducting poly(o-aminophenol) membrane by π-π stacking，and then theo-aminophenol as functional monomer and RH as template molecule were electrochemically imprinted on the film of GQDs to develop the GQDs-MIP sensor.The average lateral size of GQDs characterized by atomic force microscope(AFM) is about 20 nm.The response mechanism of the resulting sensor was investigated by differential pulse voltammetry and the linear relationship of sensor was determined by means of amperometricI-tcurve.The results indicated that the calibration curve was linear in the range of 2.0×10-6-6.1×10-4mol/L，and the detection limit(S/N=3)was 1.1×10-6mol/L.Compared with the molecular imprinting sensor without GQDs，the GQDs-MIP sensor exhibited a wide linear range and a lower detection limit.The spiked recoveries were in the range of 91.0%-101%.The sensor was applied in the analysis of RH in plasma samples with RH concentration of 4.21×10-6mol/L.In contrast to the detection result of high performance liquid chromatography(HPLC) method，this electrochemical analytical approach is credible，and could be applied in the detection of RH in clinical samples.

graphene quantum dots(GQDs)；molecular imprinting；ropivacaine hydrochloride(RH)；o-aminophenol

2014-10-03；

2014-11-20

中國(guó)藥科大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金(JKQZ2013010)

10.3969/j.issn.1004-4957.2015.02.006

O657.1；TQ460.72

A

1004-4957(2015)02-0159-05

*通訊作者：楊小弟，博士，教授，研究方向：環(huán)境分析，Tel:13951867138，E-mail：yangxiaodi@njnu.edu.cn