趙春梅 ，劉發(fā)梅，周銘濤，楊和金，黃加文，蘇 梅

(云南省藥物研究所，云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心，云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明650111)

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馬櫻花醇提物藥理作用研究及急性毒性試驗(yàn)*

趙春梅 ，劉發(fā)梅，周銘濤，楊和金，黃加文，蘇 梅

(云南省藥物研究所，云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心，云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明650111)

目的 觀察馬櫻花醇提物的藥理作用及急性毒性研究。方法 采用小鼠醋酸扭體法、小鼠二甲苯耳廓腫脹和小鼠剪尾法及玻片法止血實(shí)驗(yàn)，以及急性毒性試驗(yàn)。結(jié)果 馬櫻花醇提物能減少醋酸所致的小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，降低二甲苯所致小鼠耳廓腫脹度，促進(jìn)小鼠剪尾止血時(shí)間，促進(jìn)小鼠凝血時(shí)間。小鼠LD50為20.23 g/kg·bw(相當(dāng)于生藥43.88 g/kg·bw)。結(jié)論 提示馬櫻花醇提物具有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎、止血作用，且具有一定毒性。

馬櫻花；鎮(zhèn)痛；抗炎；止血

馬櫻花(RhododendrondelavayiFranch.)為馬櫻杜鵑的花，隸屬杜鵑花科杜鵑花屬。常綠灌木至喬木；樹皮粗厚，呈灰棕色，葉長圓狀披針形，背面密被灰白色至淡褐色海綿狀薄絨毛?；ù厣谥?，呈傘形花序式的總狀花序，深玫瑰紅色；花可入藥。原產(chǎn)滇、黔、桂等省區(qū)，緬甸也有分布。

馬櫻花不僅是道美食，而且具有清熱解毒、涼血止血的功效，具有和血、治月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、跌打損傷、風(fēng)濕痛、吐血等藥性作用。對馬櫻花的藥理作用研究極少，因此，本文對馬櫻花的乙醇提取物進(jìn)行了藥理研究，探討其在鎮(zhèn)痛、抗炎、止血方面的藥理作用，為將來開發(fā)應(yīng)用馬櫻花提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物 馬櫻花醇提取物，由云南省藥物研究所提供，70%乙醇提取3次，減壓回收，干燥。提取率為46.1%。使用時(shí)用純水配制。藥效試驗(yàn)給藥劑量以急性毒性試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)確定。阿司匹林腸溶片，100mg/片，BayerScheringPharma生產(chǎn)，批號：BJ10778；云南白藥，云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號：ZAA1323；冰醋酸，天津市天達(dá)凈化材料精細(xì)化工廠，批號：020112；二甲苯，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心，批號：20090831。

1.2 動(dòng)物SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，體重18～22g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。許可證號：SCXK(粵)2013-0002。小鼠分性別飼養(yǎng)于空調(diào)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，室溫(25±2)℃，相對濕度40～70%，喂顆粒標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水和攝食。

2 方法

2.1 鎮(zhèn)痛試驗(yàn) 取小鼠48只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，組別及劑量如表1，按照表1劑量ig給藥，每日1次，連續(xù)8天。末次給藥后45min，ip0.6%冰醋酸0.1mL/10g/只，立即記錄15min內(nèi)的扭體反應(yīng)(小鼠出現(xiàn)腹部內(nèi)凹、軀干與后肢伸張，臀部抬起反應(yīng)為準(zhǔn))次數(shù)，并計(jì)算其抑制率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

表1 馬櫻花醇提取物對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響

注：與空白對照組比，*P<0.05，***P<0.001

馬櫻花醇提取物以5.0g/kg，10.0g/kg(相當(dāng)于生藥10.84g/kg，21.69g/kg)的劑量連續(xù)灌胃給藥8天，2組均能不同程度抑制醋酸所致小鼠扭體性疼痛，抑制率分別為：46.78%、46.07%，尤以10.0g/kg劑量組作用明顯，與空白對照組相比較具有顯著性差異。顯示出鎮(zhèn)痛作用。

2.2 抗炎試驗(yàn) 選用小鼠48只，按體重隨機(jī)分為4組，每組雌雄各6只，分組及給藥情況見表2。各組均預(yù)先每日灌胃給藥1次，連續(xù)9天，對照組灌服等容量純水，各組灌胃容積均為20mL/kg體重。末次給藥后30min，各組小鼠于右耳兩面均勻涂抹二甲苯0.05mL，左耳不涂為對照。致炎后1h脫頸椎處死動(dòng)物，用直徑6mm的打孔器將雙耳同部位等面積切下，取耳片稱重，以兩耳片重量之差作為腫脹度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 馬櫻花醇提取物對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響

注：與空白對照組比，**P<0.01，***P<0.001

馬櫻花醇提取物以5.0g/kg，10.0g/kg(相當(dāng)于生藥10.84g/kg，21.69g/kg)的劑量連續(xù)灌胃給藥9天，2組均能不同程度抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹，抑制率分別為：31.04%、37.96%，尤以5.0g/kg，10.0g/kg劑量組作用明顯，與空白對照組相比較具有顯著性差異。顯示出抗炎作用。

2.3 止血試驗(yàn)(剪尾法) 取小鼠48只，體重(20±2)g，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，按照劑量ig給藥，每日1次，連續(xù)4天。末次給藥后45min，將小鼠四肢固定在操作臺上用剪刀將小鼠尾尖剪斷2mm，待血液溢出時(shí)，用秒表開始計(jì)時(shí)，每隔30s用濾紙吸去血滴直至血液不再溢出為止，計(jì)算止血時(shí)間，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 馬櫻花醇提物對剪尾法所致小鼠止血時(shí)間的影響

注：與空白對照組比，**P<0.01，***P<0.001

馬櫻花醇提物以2.50g/kg，5.00g/kg(相當(dāng)于生藥5.42g/kg，10.84g/kg)的劑量連續(xù)灌胃給藥4天，2組均能不同程度促進(jìn)小鼠剪尾止血時(shí)間，促進(jìn)率分別為：13.93%、45.77%，尤以5.00g/kg作用顯著，與空白對照組相比較具有顯著性差異。顯示出止血作用。

2.4 止血試驗(yàn)(玻片法) 選用18～22g小鼠48只，按體重隨機(jī)分為4組，每組雌雄各6只，各組均預(yù)先每日灌胃給藥1次，連續(xù)5天，對照組灌服等容量純水，各組灌胃容積均為20mL/kg體重。末次給藥45min后毛細(xì)管眼眶取血，滴于載波片，血滴直徑約5mm，立即用秒表記時(shí)。每隔30s用清潔的7號注射針頭自血滴邊緣向里輕輕撥動(dòng)，觀察有無血絲挑起。從采血開始至挑起血絲止即為凝血時(shí)間。結(jié)果見表4。

表4 馬櫻花醇提物對玻片法所致小鼠凝血時(shí)間的影響

注：與空白對照組比，***P<0.001

馬櫻花醇提物以2.50g/kg，5.00g/kg(相當(dāng)于生藥5.42g/kg，10.84g/kg)的劑量連續(xù)灌胃給藥5天，2組均能不同程度縮短小鼠摘眼球凝血時(shí)間，促進(jìn)率分別為：56.41%、53.85%，尤以2.50g/kg，5.00g/kg作用顯著，與空白對照組相比較具有顯著性差異(P<0.001，P<0.001)。顯示出止血作用。

2.5 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)

2.5.1 正式實(shí)驗(yàn) 給予供試品前動(dòng)物禁食不禁水約5h50min～6h30min。將合格的動(dòng)物稱重，按性別和體重分群，淘汰體重偏差較大的動(dòng)物，再隨機(jī)分為7組，即溶媒對照組和不同給藥供試品組，每組10只，雌雄各5只。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將馬櫻花醇提物28.00g/kg·bw作為起始劑量，以 0.9的組距向下增加5個(gè)劑量組，即25.20g/kg·bw、22.68g/kg·bw、20.41g/kg·bw、18.38g/kg·bw、16.54g/kg·bw馬櫻花醇提物劑量組，另設(shè)溶媒對照組，溶媒對照組同法給予純水。

2.5.2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.5.2.1 毒性反應(yīng) 小鼠灌胃給予供試品馬櫻花醇提物后，在4h內(nèi)出現(xiàn)毒性反應(yīng)，在4h內(nèi)出現(xiàn)毒性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為驚厥、抽搐、運(yùn)動(dòng)失調(diào)。至給藥第3天恢復(fù)。死亡動(dòng)物解剖觀察，多數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)肺充血現(xiàn)象。給藥組動(dòng)物的毒性反應(yīng)見表5。

表5 馬櫻花醇提物小鼠灌胃給藥急性毒性試驗(yàn)急性毒性癥狀及動(dòng)物死亡情況

5.2 死亡情況 給藥當(dāng)天連續(xù)觀察4h動(dòng)物死亡情況，以后每天觀察1次，連續(xù)14d，28.00g/kg·bw劑量組給藥當(dāng)日出現(xiàn)動(dòng)物死亡，給藥當(dāng)日死亡6只動(dòng)物，給藥第2天死亡4只動(dòng)物，共死亡10只動(dòng)物；25.20g/kg·bw劑量組給藥當(dāng)天死亡5只動(dòng)物，第2天死亡3只動(dòng)物，共死亡8只動(dòng)物；22.68g/kg·bw馬櫻花醇提物劑量組給藥當(dāng)天死亡3只動(dòng)物，第2天死亡4只動(dòng)物，共死亡7只動(dòng)物；20.41g/kg·bw劑量組給藥當(dāng)天死亡1只動(dòng)物，第2天死亡4只動(dòng)物，共死亡5只動(dòng)物；18.38g/kg·bw劑量組給藥第2天死亡3只動(dòng)物，共死亡3只動(dòng)物；16.54g/kg·bw劑量組給藥當(dāng)天未出現(xiàn)動(dòng)物死亡，第2天死亡2只動(dòng)物，共死亡2只動(dòng)物；動(dòng)物死亡時(shí)間及死亡數(shù)顯示出隨劑量的降低而減慢和減少，顯示出劑量-反應(yīng)關(guān)系。

5.3 體重 試驗(yàn)期間，于給藥第3、7、14d對各劑量組存活動(dòng)物稱重，存活小鼠體重均持續(xù)增長。

5.4 解剖觀察 觀察14天結(jié)束后脫頸椎處死的動(dòng)物進(jìn)行大體解剖觀察，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、卵巢、子宮、精囊、前列腺、睪丸、胃、腸及胸腔、腹腔，各組織和器官的體積、顏色、質(zhì)地等，馬櫻花醇提物各劑量組、溶媒對照組各小鼠器官均無肉眼所見異常。

2.5.3 評價(jià)與結(jié)論 在本實(shí)驗(yàn)條件下，對馬櫻花醇提物不同劑量進(jìn)行24h內(nèi)小鼠單次灌胃給藥急性毒性試驗(yàn)，可見動(dòng)物于4h內(nèi)出現(xiàn)毒性反應(yīng)，在4h內(nèi)出現(xiàn)毒性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為驚厥、抽搐、運(yùn)動(dòng)失調(diào)。至給藥第3天恢復(fù)。死亡動(dòng)物解剖觀察，多數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)肺充血現(xiàn)象。中毒癥狀和動(dòng)物死亡數(shù)顯示出劑量-反應(yīng)關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)束對存活動(dòng)物進(jìn)行大體解剖觀察，各組動(dòng)物臟器、器官的體積、顏色、質(zhì)地等均未見明顯異常。馬櫻花醇提物24h內(nèi)小鼠灌胃給藥LD50為20.23g/kg·bw(相當(dāng)于生藥43.88g/kg·bw)，95%可信限為25.18～37.80g/kg·bw(相當(dāng)于生藥54.62～82.00g/kg·bw)。提示毒性作用可能涉及中樞神經(jīng)、神經(jīng)肌肉及自主神經(jīng)。

3 討論與小結(jié)

馬櫻花是云南民間常用藥。具有清熱解毒、涼血止血的功效，馬櫻花藥理作用的活性成分及其作用機(jī)制研究較少。為了探討和開發(fā)馬櫻花的藥用價(jià)值，本文對其進(jìn)行了鎮(zhèn)痛、抗炎、止血藥理作用的實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明，急性毒性實(shí)驗(yàn)顯示，馬櫻花醇提物24h內(nèi)小鼠灌胃給藥LD50為20.23g/kg·bw(相當(dāng)于生藥43.88g/kg·bw)，表明其具有一定毒性。馬櫻花能抑制醋酸所致小鼠扭體性疼痛，能抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹，可顯著縮短小鼠止血、凝血時(shí)間，說明馬櫻花具有鎮(zhèn)痛作用、抗炎作用、止血作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為馬櫻花將來產(chǎn)品研發(fā)和臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

[1]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì)，中華本草[M].第十六卷，上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：27.

30種云南常用有毒民族藥材的安全性、藥效學(xué)及生藥學(xué)研究(NO：2012CG003)。< class="content">作者簡介：趙春梅(1973-)，女，云南昆明市人，副高級工程師，從事藥理研究。

趙春梅(1973-)，女，云南昆明市人，副高級工程師，從事藥理研究。

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