周少懷，范明宇，方紅育，李宏亮

（武漢市第三醫(yī)院，武漢 430060）

關(guān)節(jié)軟骨創(chuàng)傷性缺損及退行性變是目前困擾國內(nèi)外學(xué)者的重大難題，臨床上修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的常用方法存在不同程度的缺陷［1］。近些年來，組織工程學(xué)技術(shù)越來越廣泛地應(yīng)用于軟骨缺損的修復(fù)，其主要是以種子細胞和生物降解聚合物移植來保持、改善和修復(fù)組織功能為特征新建組織工程軟骨的新方法。本研究以殼聚糖作為組織工程負荷載體經(jīng)過基因修飾擴增原代培養(yǎng)的BM-MSCs，將構(gòu)成的細胞-支架復(fù)合物直接植入兔關(guān)節(jié)軟骨缺損處，觀察其成軟骨的病理形態(tài)及軟骨基質(zhì)的蛋白表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物15 只新西蘭大白兔購自北京維通利華實驗動物中心，1.5 月齡，體重（1±0.1）kg。

1.1.2 主要試劑DMEM、胎牛血清、無血清培養(yǎng)基Opti-MEM 購自Hyclone 公司；Lipofectimane 2000 購自Sigma 公司；殼聚糖購自ALVITO Biotechnology GmbH公司；鼠抗TGF-β1、Ⅱ型膠原多克隆抗體購自Abcam公司；鼠抗CD44、CD34、CD45、Laminin 多克隆抗體購自Santa 公司。

1.2 BM-MSCs 的分離培養(yǎng)與鑒定［1］抽取新西蘭大白兔骨髓5 mL，混合肝素溶液1 mL（2×104U/ L）抗凝，室溫下以1000 r/ min 離心5min，去除上清液；DMEM重懸、洗滌細胞，同樣條件下離心、棄上清液；10%FCS-DMEM 重懸細胞，接種于培養(yǎng)瓶中，加入含有雙抗的10% FCS-DMEM 培養(yǎng)液（青霉素G 105U/ L，鏈霉素100mg / L），37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 3 d 后首次換液，去除未貼壁細胞，此后每3 d 換液1 次。PBS沖洗BM-MSCs 爬片3 次，4%多聚甲醛PBS 室溫固定15 min；滴加鼠抗兔CD44（1：100）、CD34（1：100）、CD45（1：100）、Laminin（1：100）多克隆抗體，37 ℃溫箱中作用1 h；PBS 洗滌3 次，避光下滴加馬抗鼠熒光標記二抗（1：100），于濕盒中37°C 孵育1 h；PBS 洗滌3 次，激光共聚焦顯微鏡下觀察，用合適波段激發(fā)，采集圖像。

1.3 T G F-β1 基因修飾B M-M S C s取1×106BM-MSCs 接種于24 孔板中，當(dāng)細胞融合達到80%～90%%進行基因轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染液的配制：①為20 μL 真核表達質(zhì)粒pcDNA3- TGF-β1（濃度0.36μg/μL）加入600 μLOpti-MEM 中；②160 μL Lipofectimane 2000 加入600 μLOpti-MEM 中；③將前兩步驟中的液體混勻，室溫下靜置1 h。200μL 10% FCS-DMEM 培養(yǎng)液加入24 孔板中，再緩慢滴加轉(zhuǎn)染液200 μL，邊滴加邊晃動，37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)24 h。48 h 后改用10%FCS-DMEM 培養(yǎng)液進行篩選培養(yǎng)，此培養(yǎng)液中含有500 μg/mLG418。28 d 后出現(xiàn)陽性克隆，將其挑至培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，此時培養(yǎng)液改用含400 μg/mL G418 的10% FCS-DMEM，后轉(zhuǎn)移至25 mL 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)待用。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS15.0 統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)，劑量資料均采用表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 BM-MSCs 鑒定原代培養(yǎng)第3 d 可見長梭形細胞貼壁生長，出現(xiàn)細胞集落；1 w 后多數(shù)細胞體積變大，胞漿有突起，核居中；2 w 后細胞達到80%～90%融合（圖1）；經(jīng)過多次傳代，細胞形態(tài)保持均勻一致；免疫熒光結(jié)果顯示，CD34、CD45、Laminin 抗原表達陰性，而CD44 抗原表達呈強陽性（圖2）。

圖1 原代BM-MSCs培養(yǎng)2周（倒置相差顯微鏡×40）

圖2 原代BM-MSCs CD44表達（激光共聚焦顯微鏡×200）

1.4 殼聚糖負載BM-MSCs 修復(fù)關(guān)節(jié)缺損殼聚糖（厚0.5 cm，直徑1.5 cm，圓柱形）置于6 孔板內(nèi)，培養(yǎng)基清洗3 次；用無菌注射器分別將BM-MSCs、TGF-β1 基因修飾的BM-MSCs 細胞懸液滴加在殼聚糖表面的陷窩中（每塊殼聚糖加入細胞量為1×106/mL），每孔加入20 mL10%FCS-DMEM 培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)48 h。

15 只新西蘭大白兔隨機分為殼聚糖修復(fù)組（1 組）、殼聚糖+BM-MSCs 修復(fù)組（2 組）、殼聚糖+ TGF-β1-BM-MSCs 修復(fù)組（3 組）；無菌環(huán)境下切開兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)，暴露出雙側(cè)膝關(guān)節(jié)面，于一側(cè)膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)側(cè)髁負重區(qū)髕骨溝用手鉆（直徑5 mm 鉆頭）緩慢鉆出全層關(guān)節(jié)軟骨缺損（深度3 mm），對側(cè)膝關(guān)節(jié)作對照［2］。仔細修復(fù)關(guān)節(jié)囊后，逐層縫合。術(shù)后分籠喂養(yǎng)，不限制其活動，未進行抗炎治療。

1.5 病理學(xué)觀察術(shù)后4 w、24 w，麻醉后處死兔子，解剖雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，分離鄰近脂肪、肌肉后進行病理學(xué)大體觀察；將股骨遠端固定于10%多聚甲醛24 h，后浸泡于15%中性乙二胺四乙酸（EDTA）中脫鈣1 w，脫水、透明、透蠟、石蠟包埋、切片，行甲苯胺藍染色，封固、觀察。

1.6 蛋白質(zhì)印跡術(shù)后24 w，將股骨遠端軟骨缺損修復(fù)部分取出，切碎研磨，加入RIPA 細胞裂解液，提取總蛋白，制10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉一抗工作液（TGF-β1 1∶1000；Ⅱ型膠原1∶1000），4℃隔夜，室溫孵育二抗工作液（1∶3000）2 h，ECL 發(fā)光，借助BIO-RAD 分子成像儀激發(fā)熒光和采集目的條帶，借助Image J 分析軟件定量分析目的條帶。

2.2 病理學(xué)大體觀察關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)情況術(shù)后4 w，1組關(guān)修復(fù)側(cè)關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)被褐色纖維樣組織覆蓋，缺損加深、加大；2 組有光滑、淡粉色與軟骨形態(tài)相近的組織覆蓋，缺損略變淺；3 組有光滑、乳白色組織透明軟骨樣組織覆蓋，缺損幾乎消失。術(shù)后24 周，1 組缺損內(nèi)只要由纖維組織和少量顆粒狀軟骨組織填充，缺損非常明顯；2 組缺損幾乎被新生透明軟骨組織修復(fù)，但薄厚不均；3 組缺損完全被光滑的透明軟骨組織覆蓋、填充，與鄰近透明軟骨組織無差別。

2.3 病理組織學(xué)觀察甲苯胺藍染色情況術(shù)后24 w，1 組軟骨缺損部位無甲苯胺藍著色，以纖維組織修復(fù)為主，缺損擴大；2 組與正常軟骨銜接部有明顯的甲苯胺藍著色，軟骨細胞樣細胞較多，膠原排列紊亂，缺損中央有較多軟骨細胞，但無正常有序的排列，薄厚不均；3 組缺損區(qū)甲苯胺藍著色較深且均勻，與周圍正常軟骨組織銜接緊密，中央有大量軟骨細胞，排列有序，薄厚均勻一致。

2.4 TGF-β1 蛋白表達的鑒定3 組TGF-β1 蛋白表達明顯高于1 組和2 組（P<0.05）（圖3，表1），說明TGF-β1 基因修飾成功，pcDNA3- TGF-β1 質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)染入BM-MSCs 中。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組TGF-β1蛋白表達

2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組Ⅱ型膠原的蛋白表達3組Ⅱ型膠原蛋白表達明顯高于1 組和2 組（P<0.05），而1、2 組之間無顯著性差異（P>0.05）（圖4，表1）。

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組Ⅱ型膠原蛋白表達

表1 術(shù)后24周各組軟骨缺損修復(fù)組織TGF-β1和Ⅱ型膠原蛋白表達

表1 術(shù)后24周各組軟骨缺損修復(fù)組織TGF-β1和Ⅱ型膠原蛋白表達

與3組相比，*P<0.05

組別 樣本數(shù) TGF-β1 Ⅱ型膠原1組（殼聚糖修復(fù)組）5 0.891±0.043*1.037±0.023*2組（殼聚糖+BM-MSCs修復(fù)組）5 1.102±0.102*1.118±0.074*3組（殼聚糖+ TGF-β1-BM-MSCs修復(fù)組）52.584±0.0982.490±0.111

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨屬于特殊的結(jié)締組織，覆蓋在關(guān)節(jié)的承重面上，由軟骨細胞及軟骨基質(zhì)構(gòu)成，軟骨細胞可以合成、分泌軟骨基質(zhì)（如Ⅱ型膠原），這種分泌具有高度特異性。軟骨本身無血管、淋巴管、神經(jīng)，軟骨細胞不能繼續(xù)分化，軟骨細胞在軟骨陷窩內(nèi)故遷移受限，滑膜細胞數(shù)量少、生物活性低，因此，軟骨病變修復(fù)能力低下，會持續(xù)造成關(guān)節(jié)軟骨退變，造成關(guān)節(jié)軟骨損傷［4］。

骨髓間充質(zhì)干細胞（BM-MSCs）增殖能力強、分化能力多向、免疫原性低，以BM-MSCs 為種子細胞構(gòu)建組織工程軟骨成為臨床治療創(chuàng)傷性軟骨缺損的新手段。關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)過程主要由BM-MSCs 通過各種生長因子占主導(dǎo)的誘導(dǎo)分化形成軟骨細胞而完成。TGF-β1 能誘導(dǎo)BM-MSCs 向軟骨細胞分化［5，6］，但外源性TGF-β1 作用短暫、易于丟失、價格昂貴；若將TGF-β1 基因轉(zhuǎn)染BM-MSCs，通過高表達的TGF-β1 誘導(dǎo)BM-MSCs 向軟骨細胞分化，以此基因修飾的BM-MSCs 作為種子細胞的組織工程學(xué)技術(shù)具有重大的臨床意義。

本實驗通過骨髓原代培養(yǎng)分離BM-MSCs，免疫細胞熒光顯示CD34、CD45、Laminin 抗原表達陰性，而CD44 抗原表達呈強陽性，進一步證實分離細胞為BMMSCs。通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BM-MSCs 擴增TGF-β1 基因，誘導(dǎo)BM-MSCs 向軟骨細胞分化。殼聚糖具有較好的凝膠黏附性，與層黏連蛋白、纖維連接蛋白緊密親和，為細胞生長、分化、新陳代謝提供立體支架。本實驗應(yīng)用殼聚糖負載BM-MSCs，填充到兔的骨關(guān)節(jié)全層軟骨缺損處，觀察發(fā)現(xiàn)其能與缺損處緊密附著。本研究在不限制兔自由活動的前提下進行，術(shù)后兔可做適當(dāng)運動。術(shù)后4 w，各組的殼聚糖大部分被吸收，修復(fù)區(qū)域未見炎癥反應(yīng)，證實在軟骨組織工程中殼聚糖可作為合適的細胞外支架。

霍建忠等［2，3］研究殼聚糖復(fù)合TGF-β1 基因質(zhì)粒擴增修飾BM-MSCs 修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的短期變化，TGF-β1 在術(shù)后6 w 仍可檢測到，12 w 后軟骨缺損幾乎被透明軟骨組織填充，結(jié)構(gòu)與正常軟骨相似。本實驗主要側(cè)重觀察關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的遠期變化，術(shù)后24 w缺損區(qū)域完全被光滑、透明軟骨組織填充，與鄰近透明軟骨組織無差異，證實該修復(fù)方法穩(wěn)定可靠；術(shù)后24 w殼聚糖負載TGF-β 1-BM-MSCs 修復(fù)組仍可見TGF-β1 高表達，基因修飾技術(shù)將TGF-β1 導(dǎo)入BM-MSCs中，文獻報道［7］TGF-β1 只維持短期高表達，本結(jié)果顯示TGF-β1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BM-MSCs 可維持TGF-β1 長期高表達，說明經(jīng)過基因修飾的BM-MSCs 是非常合適的軟骨組織工程種子細胞；II 型膠原是軟骨細胞特異性細胞外基質(zhì)，是BM-MSCs 向軟骨細胞分化的重要證據(jù)，本實驗顯示術(shù)后24 w 殼聚糖負載TGF-β1-BM-MSCs修復(fù)組II 型膠原的表達遠高于其他兩組，說明缺損區(qū)域被BM-MSCs 分化的軟骨細胞和其分泌的軟骨基質(zhì)大量覆蓋修復(fù)。

本研究通過動物實驗，證實殼聚糖負載TGF-β1基因修飾的BM-MSCs 構(gòu)建組織工程軟骨修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果顯著優(yōu)于單純以殼聚糖或殼聚糖負載未基因修飾的BM-MSCs，該方法構(gòu)建的組織工程軟骨具有修復(fù)周期短、遠期療效好、明顯改善軟骨細胞的黏附能力等優(yōu)點。

［1］ 孫迎放.骨與關(guān)節(jié)損傷修復(fù)的研究進展［J］.中華損傷與修復(fù)雜志(電子版), 2014, 9(5): 478-481.

［2］ 霍建忠, 蔣淳, 郭常安, 等.轉(zhuǎn)化生長因子-β1基因修飾對骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化的影響［J］.中華手外科雜志, 2005,21(4): 245-248.

［3］ 霍建忠, 陳崢嶸, 蔣淳, 等.轉(zhuǎn)化生長因子-β1基因修飾骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合殼聚糖修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損［J］.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2005, 9(7): 393-396.

［4］ 王亦璁.骨與關(guān)節(jié)損傷［M］(第4版).北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2009:384-385.

［5］ Lim JJ, Temenoff JS.The effect of desulfation of chondroitin sulfate on interactions with positively charged growth factors and upregulation of cartilaginous markers in encapsulated MSCs［J］.Biomaterials, 2013,34(21): 5007-5018.

［6］ Qi BW, Yu Ax, Zhu SB, et al.Chitosan/poly(vinyl alcohol) hydrogel combined with Ad-hTGF-β1 transfected mesenchymal stem cells to repair rabbit articular cartilage defects ［J］.Exp Biol Med, 2013, 238(1):23-30.

［7］ 洪洋, 霍建忠, 郭常安, 等.骨髓間充質(zhì)干細胞構(gòu)建組織工程軟骨修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實驗研究［J］.中國臨床醫(yī)學(xué), 2013, 20(4):457-461.