章 慧，沈慧蕓，王億君

肺復(fù)方對Lewis肺癌裸鼠移植瘤的抑瘤作用及抗血管生成的機(jī)制研究

章 慧，沈慧蕓，王億君

（湖南省腫瘤醫(yī)院，長沙 410081）

目的：研究肺復(fù)方對裸鼠肺癌移植瘤的抑瘤作用，探討肺復(fù)方的抗血管生成作用機(jī)制。方法：將40只裸鼠隨機(jī)分空白對照組（NS組），其余32只待造模后隨機(jī)分為模型組（MX組）、恩度組（ED組）、肺復(fù)方大劑量組（FD組）、肺復(fù)方小劑量組（FX組）。觀察腫瘤大小，繪制腫瘤生長曲線和抑瘤率曲線。HE染色下進(jìn)行了病理形態(tài)學(xué)觀察。取腫瘤組織免疫組化檢測MVD。Western Blot方法檢測VEGF、VEGFR2、Ang-2、bFGF。結(jié)果：與腫瘤模型組比較，各用藥組肺癌移植瘤生長均出現(xiàn)程度不一的減慢，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡壞死。抑瘤率從高到低：恩度組＞肺復(fù)方大劑量組＞肺復(fù)方小劑量組＞模型組。各組平均灰度值與血管數(shù)目表現(xiàn)為：模型組＞小劑量組＞大劑量組＞恩度組。與模型組比較，其他各組的VEGF、VEGFR2、Ang-2、bFGF蛋白表達(dá)均有不同程度下降，其中恩度組最為明顯，除bFGF的表達(dá)大劑量組與小劑量組無差別，其余三種蛋白的表達(dá)均表現(xiàn)為：模型組＞小劑量組＞大劑量組＞恩度組。結(jié)論：黎月恒老師治療肺癌的協(xié)定處方肺復(fù)方能在一定程度上減慢腫瘤的生長，其抗腫瘤的作用可能與抑制了血管生成的正性調(diào)控因子VEGF、VEGFR2、Ang-2、bFGF的表達(dá)有關(guān)。

肺復(fù)方；抗腫瘤；抗血管生成；Levis肺癌細(xì)胞

原發(fā)性支氣管肺癌是目前全球最常見的惡性腫瘤［1-2］，隨著發(fā)病率的逐年提高，肺癌已超過癌癥死因的20%［3］。其中非小細(xì)胞肺癌發(fā)病率約占肺癌發(fā)病總數(shù)的80%［4］。2012年全球新增肺癌病例180萬，死亡人數(shù)159萬，占癌癥死亡總數(shù)的19.4%，其中高出1/3的病例出現(xiàn)在中國，約2/3的肺癌患者確診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)機(jī)會(huì)［5］，如不予抗腫瘤治療，平均生存期為4～5個(gè)月［6］。因此探討肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制和治療的有效方法具有重要性?！梆B(yǎng)陰清解”法是黎月恒老師治療肺癌的重要的學(xué)術(shù)思想，根據(jù)該治法擬定了肺復(fù)方。通過運(yùn)用該方治療氣陰兩虛、邪毒內(nèi)蘊(yùn)型非小細(xì)胞肺癌的臨床研究，顯示此方在穩(wěn)定瘤體、減輕化療毒副作用、改善患者臨床癥狀和生活質(zhì)量、提高免疫力等方面均顯示出較好療效［7-21］。本課題在臨床研究的基礎(chǔ)上，建立Lewis肺癌裸鼠移植瘤模型，通過腫瘤生長曲線和抑瘤效果觀察，HE染色檢測移植瘤的病理變化，免疫組化檢測微血管密度（microvessel density，MVD），Western Blot檢測血管生成相關(guān)因子VEGF、VEGFR2、Ang-2、bFGF蛋白的變化，擬通過體內(nèi)觀察肺復(fù)方對Lewis肺癌裸鼠移植瘤的抑瘤作用，研究其抗血管生成的機(jī)制，為肺復(fù)方的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1　資料與方法

1.1細(xì)胞株 Lewis鼠源性肺腺癌細(xì)胞，購于ATCC細(xì)胞庫。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/C裸鼠40只，雌雄各半，6～8周齡，體重18～22克。裸鼠均購于湖南斯萊克公司。

1.3主要實(shí)驗(yàn)藥品、分組和用藥 肺復(fù)方：百合10g、麥冬10g、熟地10g、生地10g、玄參10g、當(dāng)歸10g、白芍10g、沙參15g、桑白皮15g、黃芩15g、蚤休15g、臭牡丹15g、蛇舌草15g，購于湖南省腫瘤醫(yī)院，經(jīng)過湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)專家周日寶鑒定。水煎醇沉為25 mL，大劑量組每毫升含生藥6.2g，小劑量組每毫升含生藥2.05g，大、小劑量組每毫升含生藥為3：1。無菌4℃保存。恩度：15 mg/支，山東先聲麥得津生物制藥有限公司出品，產(chǎn)品批號(hào)：國藥淮字S20050088。稀釋為濃度0.2 mg/mL。

先將40只裸鼠按照隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分出8只空白對照組（NS組），其余32只待出瘤后（造模后第7天）按隨機(jī)數(shù)字法分為模型組（MX組）、恩度組（ED組）、肺復(fù)方大劑量組（FD組）、肺復(fù)方小劑量組（FX組）?？瞻讓φ战M：一般處理，常規(guī)給予食物、水；模型組：取蒸餾水0.2mL灌胃；恩度組：每次0.2 mL（恩度濃度0.2mg/mL）腹腔注射；肺復(fù)方大劑量組：每次灌胃0.2 mL（肺復(fù)方濃度6.2g/mL）；肺復(fù)方小劑量組：每次灌胃0.2 mL（肺復(fù)方濃度2.05g/mL）。除空白對照組，每組灌胃或腹腔注射均為每日上午9點(diǎn)一次，用藥14天。

1.4主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）；蘇木素-伊紅染色液（上海滬峰生物科技有限公司）；免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）；恒溫水浴箱（Heto公司）；超凈工作臺(tái)（上海旦鼎公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國）；光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）；WB一抗：VEGF、VEGFR2、Ang-2（abcam Company，USA）；WB一抗：bFGF、GAPDH（Santa Company，USA）；WB二抗（Sigma，USA）。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1建立皮下移植瘤小鼠模型 復(fù)蘇后的Lewis小鼠源性肺腺癌細(xì)胞制成濃度1×107/mL細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)基內(nèi)，在37℃和5%CO2的條件下傳代培養(yǎng)。收集生長達(dá)80%左右的肺腺癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1× 107/mL。于小鼠后臀部，皮下注射約0.2mL細(xì)胞懸液。

1.5.2觀察指標(biāo)

1.5.2.1常規(guī)指標(biāo)監(jiān)測 定期觀察裸鼠一般情況，如精神，飲食，睡眠，大小便，毛發(fā)光澤，活躍程度，給藥后第7、9、11、13、15、17、19、21天分別用游標(biāo)卡尺測量荷瘤裸鼠腫瘤長（a）短徑（b），計(jì)算瘤體積（公式：V（mm3）=ab2π/6）。然后頸椎脫揪法處死老鼠，剝離腫瘤，稱瘤重量，計(jì)算腫瘤生長抑制率，繪制腫瘤生長抑制率圖。腫瘤生長抑制率（%）=（模型組腫瘤質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組腫瘤質(zhì)量）/模型組腫瘤質(zhì)量×100%。

2.2.2病理形態(tài)學(xué)觀察 適量腫瘤組織制成石蠟切片，切片厚度3～5 μm，經(jīng)HE染色后觀察標(biāo)本病理改變。

2.2.3免疫組化檢測MVD 適當(dāng)腫瘤組織制成石蠟切片，切片厚度3μm，用CD34免疫組化染色。

2.2.4Western Blot方法檢測VEGF、VEGFR2、Ang-2、bFGF的蛋白含量 常規(guī)方法提取各組0.5mg組織總蛋白，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂奶粉（PBS配制）在37℃恒溫下封閉2h。一抗為VEGF（42KD，稀釋度1：1000）、VEGFR2（200KD，稀釋度1：500）、Ang-2（57KD，稀釋度1：500）、bFGF（24KD，稀釋度1：1000）、GAPDH（37KD，稀釋度1：500）。二抗為酶標(biāo)，加ECL發(fā)光底物試劑，得到膠片。

2.3統(tǒng)計(jì)方法 所有數(shù)據(jù)使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示多組樣本均數(shù)間比較，符合方差齊性用單因素方差分析，不符合方差齊性用秩和檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1一般情況 肺癌裸鼠移植瘤模型建立后，各組裸鼠一般情況基本正常，其中空白對照組裸鼠精神狀態(tài)好，反應(yīng)敏捷，皮膚紅潤有光澤，體重正常增加，無死亡。而其他小鼠精神狀態(tài)欠佳，反應(yīng)較遲鈍，皮膚欠紅潤、光澤，體重增加較緩，無死亡，且造模后最早在第5天皮下部位出現(xiàn)小米粒大小的紅色小硬結(jié)，所有造模小鼠最遲第7天出現(xiàn)皮下部位的紅色小硬結(jié)，成瘤率100%，腫瘤出現(xiàn)后迅速生長，其中以模型組腫瘤生長最快，壓迫癥狀最明顯，其余各組腫瘤生長速度明顯減慢。

2.2根據(jù)各組肺癌裸鼠移植瘤的生長情況繪制曲線各組小鼠移植瘤體積變化曲線見圖1。

圖1　各組裸鼠腫瘤生長曲線

由圖1可見，與腫瘤模型組比較，各用藥組肺癌移植瘤生長均出現(xiàn)程度不一的減慢，減慢程度比較恩度組＞肺復(fù)方大劑量組＞肺復(fù)方小劑量組＞模型組。

2.3腫瘤生長抑制率 各組小鼠移植瘤生長抑制率比較見圖2。

圖2　腫瘤生長抑制率

由圖2可以看出，肺復(fù)方大、小劑量組和恩度的抑瘤率分別為：19.46%、8.05%、33.56%。抑瘤率從高到低恩度組＞肺復(fù)方大劑量組＞肺復(fù)方小劑量組＞模型組。

2.4腫瘤病理形態(tài)學(xué)結(jié)果 從圖3可以看出：模型組：腫瘤細(xì)胞充滿整個(gè)視野，腫瘤細(xì)胞大，明顯可見出現(xiàn)多核，排列不規(guī)則；幾乎沒有觀察到凋亡、壞死細(xì)胞，伊紅染色少即間充質(zhì)纖維少。恩度組：可見腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)大量的凋亡壞死；細(xì)胞核出現(xiàn)融合裂解，無明顯的細(xì)胞核形態(tài)；大片的伊紅染色，壞死細(xì)胞被充質(zhì)纖維填充。肺復(fù)方大劑量組：可見細(xì)胞核出現(xiàn)融合變圓，胞質(zhì)皺縮，出現(xiàn)較多細(xì)胞凋亡和壞死。肺復(fù)方小劑量組：大部分細(xì)胞胞體較大，小部分細(xì)胞核出現(xiàn)融合變圓，胞質(zhì)皺縮；少量細(xì)胞凋亡和壞死。

2.5肺癌移植瘤微血管密度表達(dá) 各組腫瘤組織病理標(biāo)本經(jīng)過CD34染色，腫瘤組織間質(zhì)血管均有染色，各組微血管的大小，形態(tài)，數(shù)目有較大差異（見表1及圖4）。從表1及圖4可以看出，模型組微血管密度即平均灰值最高，為138.92，模型組的血管數(shù)目也最高，為88.13。各組平均灰度值與血管數(shù)目表現(xiàn)為：模型組＞小劑量組＞大劑量組＞恩度組（P＜0.01），即對腫瘤組織的微血管生成的抑制作用強(qiáng)弱依次為：恩度組＞大劑量組＞小劑量組＞模型組。

圖3　HE染色（×400）

*與模型組比較P＜0.01

圖4　IHC染色（×400）

2.6Western Blot結(jié)果 從表2及圖5可以看到，在肺癌移植瘤組織中，與模型組比較，各組的VEGF、VEGFR2、Ang-2、bFGF蛋白表達(dá)均有不同程度下降，其中恩度組最為明顯（P＜0.01），肺復(fù)方大、小劑量組與模型組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。各組組內(nèi)比較中，除bFGF的表達(dá)大劑量組與小劑量組無差別，其余三種蛋白的表達(dá)均表現(xiàn)為：模型組＞小劑量組＞大劑量組＞恩度組（P＜0.01）。

表2　腫瘤組織VEGF、VEGFR2、Ang-2、bFGF蛋白表達(dá)比較（x±s）

圖5　VEGF、VEGFR2、Ang-2、bFGF蛋白的western-blot條帶

3　討論

1971年，F(xiàn)olkman提出腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管新生過程。其主要步驟包括：原發(fā)癌灶的生長，腫瘤血管的生成，腫瘤細(xì)胞脫落并侵入基底膜，進(jìn)入脈管系統(tǒng)，導(dǎo)致癌栓形成，繼發(fā)癌的生長，腫瘤血管生成，轉(zhuǎn)移瘤的繼續(xù)擴(kuò)散［22］。通過抑制腫瘤血管形成，減慢腫瘤生長的速度，以及降低腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，是目前抗腫瘤研究的重要方向［23］。

腫瘤血管的生成主要依靠血管生長促進(jìn)因子和血管生長抑制因子的調(diào)控，調(diào)控因子分正性調(diào)控因子和負(fù)性調(diào)控因子兩大類［24］。主要正性調(diào)控因子有：1.血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）；2.堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）；3.粘附因子等。主要負(fù)性調(diào)控因子有：1.腫瘤抑制基因；2.血管生長抑制素AS和內(nèi)皮生長抑制素ES；3.血小板反應(yīng)蛋白等。其中正性調(diào)控因子研究最多也是最重要的是VEGF及其受體（VEGFR）。有研究認(rèn)為血清檢測VEGF，VEGFR2對肺癌患者的診斷具有普遍性，可以作為診斷檢測方法之一［25］。Mochizukil最新研究證明：在成熟組織和培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中Ang2有促進(jìn)血管生成作用［26］。有大量研究表明Ang2跟VEGF具有協(xié)同作用，共同促進(jìn)腫瘤血管的生成［27］。bFGF在體內(nèi)和體外均能明顯促進(jìn)血管形成，可直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放基底膜降解酶，并可趨化血管內(nèi)膜的各類細(xì)胞并促進(jìn)其增殖和遷移［28］。MVD被認(rèn)為是最理想的反映腫瘤血管生成情況的指標(biāo)，大多數(shù)研究認(rèn)為MVD值高是預(yù)后不佳的指標(biāo)。

肺復(fù)方具有益氣養(yǎng)陰、化痰散瘀、清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)、攻補(bǔ)兼施之效。本實(shí)驗(yàn)肺復(fù)方表現(xiàn)出對肺癌移植瘤的抑制作用，雖不及恩度組明顯，但是仍具有一定的意義，黎月恒老師治療肺癌的協(xié)定處方肺復(fù)方對肺癌移植瘤能在一定程度上減慢腫瘤的生長，其抗腫瘤的作用可能跟抑制了血管生成的正性調(diào)控因子VEGF、VEGFR2、Ang-2、bFGF的表達(dá)有關(guān)，但本研究對抑制血管生成的過程中確切的作用機(jī)制尚不完全明確，需要進(jìn)一步探討。

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Study of Inhibitory Effect of Lung Compound on Transplanted Lewis Lung Carcinoma Cell in Nude Mice and It's Mechanism of Anti-angiogenesis

Zhang Hui， Shen Hui-yun， Wang Yi-jun
（Hunan Caucer Hospital， Changsha 410013， China）

Objective Researched the influence of the Fei Fufang for nude mouse lung transplantation tumor， Explore the mechanism of the Fei Fufang. Methods Random points 8 from 40 nude mice as the blank control group （NS）， the rest of the 32 only after building were randomly divided into the model group （MX）， the degree group （ED）， the Fei Fufang high-dose group （FD）and the Fei Fufang low-dose group （FX）. Observing the tumor size， tumor growth curve drawing. To observe the pathological morphology under the HE dyed.Take the tumor tissue to detect the MVD （microvascular density）， Take the tumor tissue to detect VEGF， VEGFR2， Ang-2 and bFGF by Western Blot method. Results Compared with tumor model group， the treatment group lung transplantation tumor growth slow in varying degrees， visible tumor cell necrosis appeared apoptosis. Inhibitory rate fromhigh to low：Endostar group＞High dose group＞small dose group＞control group. For each group， mean gray values and amount of blood vessels showing that：control group＞small dose group＞High dose group＞Endostar group. Compared with model group，there shows different degrees of decline in protein expression of other groups' VEGF ，VEGFR2， Ang-2 and bFGF， among which endostar group reduced most dramatically with statistical meanings.There was no difference in the expression of bFGF between high-dose group and small dose group，nevertheless，the rest of the three kinds of protein expression intensity arrangements were as follows：model group ＞ High dose group＞ small dose group＞Endostar group. Conclusion Agreement prescription Fei Fufang of Professor LiYueheng slow down the growth of the tumor to a certain extent.Its anti tumor effect may be related to the inhibition of the expression of the positive regulation factors VEGF， VEGFR2， Ang-2 and bFGF of angiogenesis. Inhibition of angiogenesis may also be one of the mechanisms of Fei Fufang prevention and treatment of recurrence and metastasis of lung cancer.

Fei fufang； anti-tumor； anti-angiogenesis； levis lung cancer cells.

R979.1

A

1673-016X（2015）06-0111-05

2015-02-02

章慧，E-mail:382793382@qq.com