劉 靜，李月娟，許敬東，韓 玲

（1.甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070）

亞硝酸鹽作為一種國家允許使用的食品添加劑，被廣泛應用于腌制香腸、臘肉和火腿等肉制品中[1]。其可緩慢的分解釋放出一氧化氮（NO）使肉中的肌紅蛋白亞硝基化形成穩(wěn)定的亞硝基肌紅蛋白色素，改善肉制品的色澤和風味；同時，亞硝酸鹽還可抑制肉毒梭狀芽孢桿菌，防止肉類制品的腐敗變質(zhì)，延長肉制品的保質(zhì)期[2-3]。然而，亞硝酸鹽不僅本身具有毒性，而且常因使用過量或使用方法不當而嚴重危害人體健康[4-5]。若亞硝酸鹽使用過量（＞150 mg/kg），會導致殘留的亞硝酸根和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物仲胺結合生成亞硝胺，亞硝胺在人體內(nèi)達到一定劑量時可致癌、致畸、致突變；體內(nèi)過量的亞硝酸鹽還可使血液中的二價鐵離子氧化為三價鐵離子，使正常紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)楦哞F血紅蛋白，失去攜氧能力，引起組織缺氧，發(fā)生亞硝酸鹽中毒[6-7]。亞硝酸鹽可從以下幾個途徑而來：直接添加到食品中或由添加的硝酸鹽轉(zhuǎn)化而來的亞硝酸鹽、蔬菜或淹漬食品中產(chǎn)生的亞硝酸鹽、環(huán)境中產(chǎn)生的亞硝酸鹽、燃燒石油類燃料、煤炭、天然氣等產(chǎn)生的亞硝酸鹽等[8-9]。

有關食品中亞硝酸鹽檢測的研究報道很多，主要研究的是亞硝酸鹽的定性檢測和定量檢測兩種。亞硝酸鹽的定性檢測方法主要有試劑盒法和試紙法[10]；定量檢測方法主要有：光度法（分光光度法、催化光度法、熒光光度法、流動注射分光光度法），化學發(fā)光法，電化學法（伏安法、極譜法），色譜法（氣相色譜法、高效液相色譜法、離子色譜法），毛細管電泳法[11]等。以上定量檢測方法均具有靈敏度高、選擇性好等特點，但這些方法都需要借助儀器來完成，而且所需儀器設備昂貴，實驗操作復雜，同時對方法的精密度要求也較高，不易達到[12]。因此，尋求操作簡單且易于實現(xiàn)的亞硝酸鹽檢測方法具有重要的現(xiàn)實意義。

目前，市場上常用的亞硝酸鹽檢測試劑盒或試紙大多是根據(jù)國標方法制成的[13]。國標法存在兩個關鍵性的問題：首先，必須在酸性環(huán)境中進行，酸度的高低直接影響產(chǎn)物的生成；其次，分兩步完成，中間反應轉(zhuǎn)化率的高低也直接影響產(chǎn)物的生成[14-15]。為了解決傳統(tǒng)方法存在的問題，本實驗研究了一種新的亞硝酸鹽快速檢測方法，利用亞硝酸鹽和鹽酸間苯二胺發(fā)生重氮化偶聯(lián)反應的原理，以定性中速濾紙為原料，通過在不同濃度的偶聯(lián)試劑中浸泡，采用不同的試紙干燥法，最終確定了試紙顯色的最佳條件。本方法與傳統(tǒng)方法相比具有兩個優(yōu)點：（1）反應中用到的顯色劑鹽酸間苯二胺本身攜帶酸根，可以直接提供反應所需的酸性環(huán)境，無需外加其他酸，避免了外加酸對反應酸度的影響；（2）該反應一步完成，不存在中間反應，從而提高了產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。該方法最低檢出限可達1.0 mg/L，而且實驗所用試劑易得、操作簡單，所用試紙攜帶方便，成本低廉，能滿足亞硝酸鹽定性和半定量檢測的需求，具有較高的應用價值和廣闊的市場開發(fā)前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞硝酸鈉：煙臺市雙雙化工有限公司；鹽酸間苯二胺：天津市光復精細化工研究所；乙酸鋅溶液：上海中秦化學試劑有限公司；亞鐵氰化鉀溶液、硼酸鈉：天津市凱通化學試劑有限公司；對氨基苯磺酸：天津市天新精細化工開發(fā)中心；鹽酸萘乙二胺：上海中秦化學試劑有限公司；定性濾紙及定量濾紙：杭州沃華濾紙有限公司；層析濾紙：上海創(chuàng)賽科學儀器有限公司。

1.2 儀器與設備

DU-20G電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；DHG-9145A型電熱恒溫鼓風干燥箱、DZF-6020型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司；Evolution 60型紫外可見分光光度計：美國Thermo Scientific公司。

1.3 試驗方法

本實驗利用亞硝酸鹽與鹽酸間苯二胺發(fā)生重氮化偶聯(lián)反應，生成橙紅色偶聯(lián)產(chǎn)物環(huán)偶氮亞氨基苯的原理，隨著亞硝酸鹽濃度的增大，產(chǎn)物的顏色逐漸加深，通過優(yōu)化顯色劑濃度、顯色時間、浸泡時間以及選擇色階明顯、變形程度小的試紙材料和最佳的干燥方式，找到了一種試劑盒法和試紙法快速檢測食品中亞硝酸鹽的新方法。實驗通過將顯色后的樣液和試紙條與標準比色卡對比，根據(jù)顏色的深淺就可以大致判斷亞硝酸鹽的含量范圍。反應式如下：

1.3.1 試劑盒檢測法

（1）標準比色卡的制作

配制質(zhì)量濃度為1.0 g/L的鹽酸間苯二胺溶液，分別與質(zhì)量濃度為1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、8.0 mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L、30.0 mg/L、50.0 mg/L和80.0 mg/L的亞硝酸鈉標準溶液進行顯色，制作標準比色卡。不同質(zhì)量濃度的亞硝酸鹽顯色結果如圖1所示。

圖1 試劑盒法檢測亞硝酸鹽標準比色卡Fig.1 Standard color cards of sodium nitrite detected by kit methods

（2）試樣檢測

液體樣品：直接取澄清的液體樣品1.0 mL加入檢測管中，蓋上蓋，將試劑混勻，顯色10 min后與標準比色卡比較，讀取結果；固體樣品：取粉碎均勻的固體試樣1.0 g于潔凈干燥的比色管中，加入10.0 mL蒸餾水，搖勻后浸泡10 min，取上清液參照液體樣品的檢測方法進行檢測。

1.3.2 試紙檢測法

（1）試紙條的制作

分別選用定性（快、中、慢速）濾紙、定量（快、中、慢速）濾紙和層析濾紙進行試驗，將試紙剪成長4 cm，寬1 cm的大小，分別在不同質(zhì)量濃度的顯色劑中浸泡不同的時間，取出后采用不同的干燥方式進行干燥，然后用不同質(zhì)量濃度的亞硝酸鈉溶液進行顯色，通過比較，選擇顯色速度快、顏色變化明顯、變形程度小的濾紙作為試驗用試紙材料。

（2）標準比色卡的制作

分別配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、30.0 mg/L、50.0 mg/L和80.0 mg/L的亞硝酸鈉標準溶液，將選擇好的試紙分別浸入上述溶液中，待試紙完全浸透后取出，加顯色劑使之顯色，采用真空干燥的方式使制得的試紙條干燥，即為標準比色卡。

（3）樣品檢測

液體樣品：用潔凈干燥的容器取樣品適量，將試紙條全部浸入樣液，待顯色10 min后取出，將試紙條水平放置，與標準比色卡比較，讀取結果；固體樣品：取10 g樣品研碎后放入潔凈干燥的容器中，加適量蒸餾水浸泡大約10 min，取上清液參照液體食品的方法進行檢測。

2 結果與分析

2.1 顯色條件的確定

2.1.1 顯色劑濃度

室溫條件下分別配制一系列不同質(zhì)量濃度的顯色劑鹽酸間苯二胺，將選擇好的試紙條浸入各溶液中，浸泡一定的時間后取出，采用40 ℃真空干燥的方式干燥1 h，然后浸入不同質(zhì)量濃度的亞硝酸鈉溶液中10 min使其顯色，取出后觀察各自的顯色情況。通過比較，最終選擇30.0 g/L作為顯色劑的最佳顯色質(zhì)量濃度。不同濃度顯色劑的顯色情況見表1。

表1 不同濃度顯色劑的顯色情況Table 1 Color developing agent of different concentrations

2.1.2 顯色時間

分別制作一系列用不同質(zhì)量濃度顯色劑浸泡過的濾紙條，經(jīng)40 ℃真空干燥1 h后取出，再用不同質(zhì)量濃度的亞硝酸鈉進行顯色，分別顯色2 min、5 min、7 min、10 min、15 min、20 min，結果見表2。

表2 時間對顯色效果的影響Table 2 Effect of time on coloring

由表2可知，2 min后開始顯色，到達10 min時顏色變化趨于穩(wěn)定，以后基本保持不變，所以，本實驗選擇10 min作為最佳的顯色時間。

2.2 試紙材料的選擇

表3 不同濾紙對顯色效果的影響Table 3 Effect of different filter paper on coloring

本實驗分別選取定性（快、中、慢速）濾紙、定量（快、中、慢速）濾紙和層析濾紙作為試紙材料，在30.0 g/L鹽酸間苯二胺中浸泡一定的時間，經(jīng)真空干燥后與亞硝酸鈉進行顯色，觀察濾紙的顯色情況和變形程度，結果見表3。

通過比較，本實驗選擇顯色速度快、色階變化明顯、基本無變形的定性中速濾紙作為制作試紙條的最佳材料。

2.3 浸泡時間的選擇

以定性中速濾紙為材料，分別在30.0 g/L的顯色劑中浸泡5 min、10 min、15 min、20 min、30 min，當浸泡時間＞10 min后，顯色劑在濾紙上的吸附已基本達到平衡，結合溫度、溶液的pH值、接觸時間等因素，本實驗選擇浸泡時間為20 min。

2.4 試紙烘干方式的選擇

對浸泡過的濾紙條采用不同的方式進行干燥，通過對比，選擇最佳的干燥方式。結果如表4所示。

表4 不同干燥方式對顯色效果的影響Table 4 Effect of different drying methods on coloring

由表4可知，經(jīng)40 ℃真空干燥過的試紙條顯色效果最佳，其余干燥方式的顯色效果均有底色干擾。這是由于濕潤的試紙受到空氣中氧氣的氧化或者發(fā)生光化學反應而發(fā)生了變質(zhì)，從而造成一定的試驗誤差。

2.5 保質(zhì)期試驗結果

在低溫避光條件下保存試紙，分別保存1 d、2 d、5 d、1周、2周、3周、1個月，然后用不同質(zhì)量濃度的亞硝酸鈉標準溶液對其顯色，結果發(fā)現(xiàn)，采用不同保存時間保存的濾紙條，其顯色時間和顏色變化基本一致，表明采用該方法制得的試紙條的穩(wěn)定性較好，可在低溫避光條件下保存1個月。

2.6 檢測限評價

用已經(jīng)制備好的試紙對不同質(zhì)量濃度的亞硝酸鈉進行顯色，結果如表5所示。

表5 亞硝酸鈉檢測限評價Table 5 Detection limit evaluation of sodium nitrite

由表5可知，該方法的最低檢出限為1.0 mg/L，檢測范圍為1.0～80.0 mg/L。

2.7 方法評價

分別用國標方法和試紙法對試驗采集到的香腸樣和火腿腸樣進行測定，結果見表6，優(yōu)缺點比較見表7。

表6 國標法與試紙法檢測結果對比Table 6 Comparison of detection result by National Standard method and test paper method

表7 試紙法與國標法優(yōu)缺點比較Table 7 Advantages and disadvantages comparison between National Standard method and test paper method

由表6、表7可以看出，采用國標法測定3種樣品亞硝酸根含量的結果均在試紙法的測定范圍內(nèi)，且操作簡單，所需時間短。所以，在對測定結果要求不太嚴格的情況下，可以采用試紙法進行半定量的檢測。

3 結論

本實驗以定性中速濾紙為試紙材料，鹽酸間苯二胺溶液為顯色劑，通過優(yōu)化顯色劑濃度、顯色時間等影響因素，得到了制備試紙的最佳條件：將定性中速濾紙在30.0 g/L鹽酸間苯二胺中浸泡20 min，經(jīng)40 ℃真空干燥后，低溫避光條件下密封保存。該方法最低檢出限可達1.0 mg/L，檢測范圍為1.0～80.0 mg/L，制得的試紙條攜帶方便，制作成本低廉，且能滿足一般食品中亞硝酸鹽定性和半定量檢測的需求。

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