張翔宇，譚興和，蔡 文，盧 卡，張 喻,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

芹菜（celery）屬傘形花科1年生或2年生草本植物，是一種豐富的可再生植物資源[1]。芹菜開始在我國(guó)被作為藥用植物栽培，種植面積廣泛[2]。芹菜具有降血壓和血糖、抗動(dòng)脈硬化、抗病毒、抗氧化以及增強(qiáng)免疫力等生物活性和藥用價(jià)值[3]。研究表明[4]，其諸多的生理功效中，大多數(shù)都與黃酮有關(guān)[4-6]。黃酮（flavonoids）是一種天然植物成分，泛指兩個(gè)苯環(huán)（A環(huán)與B環(huán)）通過三碳鏈相互聯(lián)接而成的一系列（C6-C3-C6）化合物[7]。芹菜葉中的黃酮大多數(shù)以糖苷形式存在，其中最主要的是芹菜素[8]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，芹菜黃酮與竹葉黃酮一樣具有較高的生物活性，包括抗氧化活性以及清除自由基[9]的作用?？傊?，芹菜黃酮種類豐富，提取簡(jiǎn)單方便，生物活性高[10-11]，具有較高的研究?jī)r(jià)值和開發(fā)潛力。

為了能夠更容易的提取芹菜中總黃酮，試驗(yàn)采用纖維素酶酶解法協(xié)同超聲法來進(jìn)行提取。多種方法的有效結(jié)合，可以優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，在溫和可控的條件下提取更多的黃酮類化合物。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，優(yōu)化工藝條件，為芹菜中總黃酮的深入研究做準(zhǔn)備，并為其工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論參考和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芹菜：購(gòu)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)濱湖市場(chǎng)，于鼓風(fēng)干燥箱中用40 ℃溫度干燥后，粉碎過80目篩，備用；纖維素酶（酶活力360 U/g）：上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)食品藥品檢定研究院；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WFJ7200分光光度計(jì)：北京萊伯泰科有限公司；KQ5200DE超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-82水浴恒溫振蕩器：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；ZN-400A高速中藥粉碎機(jī)：長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)中南制藥機(jī)械廠；TDZ5臺(tái)式低速離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 芹菜中總黃酮提取工藝流程

芹菜→切碎烘干→粉碎→過60目篩→溶解（體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇）→調(diào)節(jié)pH值→進(jìn)行超聲處理→酶解（加入纖維素酶）→水浴提?。?0 ℃）→滅酶（80 ℃、5 min）→離心分離（5 000 r/min）→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇→總黃酮粗提物

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法[12-13]，設(shè)計(jì)試驗(yàn)如下：精密稱取于120 ℃減壓干燥至恒質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg于100 mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇置于水浴中加熱溶解，冷卻后用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇定容，搖勻，即得到0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。準(zhǔn)確吸取該蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL分別置于25 mL容量瓶中，分別加體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液至5 mL，加5% NaNO2溶液0.75 mL，搖勻，放置6 min，再加10% Al（NO3）3溶液0.75 mL，搖勻，放置6 min，加4%NaOH溶液10 mL，用蒸餾水定容，搖勻，放置15 min。以試劑空白作為參比，在最大吸收波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度值。

1.3.3 芹菜中總黃酮提取量的測(cè)定及得率的計(jì)算

準(zhǔn)確吸取l mL總黃酮提取液置于25 mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇4 mL，然后按照1.3.2的方法操作。以空白試劑為參比，在最大吸收波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度值，由蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算提取液中總黃酮的質(zhì)量濃度，再按如下公式計(jì)算芹菜中總黃酮得率[14]：

式中：C為提取液黃酮類物質(zhì)的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液的總體積，mL；M為芹菜干基質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

在超聲功率200 W、超聲時(shí)間15 min、料液比1∶25（g∶mL）、加酶量150 U/g、pH 4.0的基礎(chǔ)上，相應(yīng)變換各因素的水平：超聲功率選擇100 W、150 W、200 W、250 W、300 W；超聲時(shí)間選擇10 min、20 min、30 min、40 min、50 min；料液比選擇1∶10（g∶mL）、1∶15（g∶mL）、1∶20（g∶mL）、1∶25（g∶mL）、1∶30（g∶mL）；加酶量選擇150 U/g、180 U/g、210 U/g、240 U/g、270 U/g；pH選擇3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。按照1.3.2的方法提取芹菜中總黃酮，考察各因素對(duì)芹菜總黃酮的得率影響。

1.3.5 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction technology optimization

以總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察酶解pH值、加酶量、超聲功率、料液比和超聲時(shí)間5個(gè)因素的影響，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行L16（45）正交試驗(yàn)，確定超聲波-纖維素酶協(xié)同方法醇提芹菜中總黃酮的最佳工藝條件，正交試驗(yàn)因素水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的建立

以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=12.243x-0.010 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 3，線性范圍為0～20 μg/mL，結(jié)果表明，蘆丁質(zhì)量濃度與吸光度值具有良好的線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 酶解pH值對(duì)芹菜中總黃酮得率的影響

在加酶量為210 U/g，超聲功率200 W，料液比為1∶25（g∶mL），超聲時(shí)間40 min條件下，考察pH值對(duì)芹菜中總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 pH對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of pH on total flavonoids yield

由圖2可知，在pH值為5.0時(shí)，芹菜中總黃酮的得率最大。每種酶在最佳作用pH值區(qū)間里，能夠發(fā)揮纖維素酶的最大活力，使之最大限度破壞細(xì)胞壁，減小傳質(zhì)阻力，加速芹菜中黃酮類化合物的溶出效率；當(dāng)pH值＜5.0或＞5.0時(shí)，化學(xué)環(huán)境使酶活力下降，總黃酮得率下降趨勢(shì)明顯。因此，選擇pH值為5.0為宜。

2.3 加酶量對(duì)芹菜中總黃酮得率的影響

在pH值為5.0，超聲功率200 W，料液比為1∶25（g∶mL），超聲時(shí)間40 min條件下，考察加酶量對(duì)芹菜中總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 加酶量對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on total flavonoids yield

由圖3可知，隨著纖維素酶用量的增加，總黃酮得率不斷上升。當(dāng)加酶量達(dá)到210 U/g時(shí)，總黃酮得率基本已達(dá)到最大值。纖維素酶在酸性介質(zhì)中催化芹菜中的纖維素等多糖水解，導(dǎo)致細(xì)胞壁部分破損，細(xì)胞膜通透性增加，減少了黃酮向主體溶劑中擴(kuò)散的阻力，從而加速黃酮的釋放[15]。由圖3可知，加酶量＞210 U/g以后，溶液中酶與底物濃度達(dá)到飽和狀態(tài)，總黃酮得率變化不大。因此選擇210 U/g作為加酶量最佳添加量。

2.4 超聲功率對(duì)芹菜中總黃酮得率的影響

在pH值為5.0，加酶量為210 U/g，料液比為1∶25（g∶mL），超聲時(shí)間40 min條件下，考察超聲功率對(duì)芹菜中總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on total flavonoids yield

由圖4可知，芹菜中總黃酮的得率隨著超聲功率的上升而提高。超聲波機(jī)械和空化作用使芹菜細(xì)胞壁破碎，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的黃酮向溶劑中擴(kuò)散，而且超聲波還有熱作用，更進(jìn)一步促進(jìn)其成分?jǐn)U散，使黃酮類化合物更容易溶解到溶劑中，提高得率。因此選擇200 W作為最佳的超聲功率。

2.5 料液比對(duì)芹菜中總黃酮得率的影響

在pH值為5.0，加酶量為210 U/g，超聲功率200 W，超聲時(shí)間40 min條件下，考察料液比對(duì)芹菜中總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 料液比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on total flavonoids yield

由圖5可知，料液比在1∶10～1∶30（g∶mL）范圍內(nèi)總黃酮得率變化趨勢(shì)是先增大后減少，當(dāng)料液比達(dá)到1∶25（g∶mL）時(shí)，總黃酮得率增加至最大，之后開始下降，這是因?yàn)槿軇┝吭礁?，乙醇與芹菜粉末之間的接觸面積變大，從而有利于促進(jìn)黃酮成分的溶出。因此選擇最適料液比為1∶25（g∶mL）。

2.6 超聲時(shí)間對(duì)芹菜中總黃酮得率的影響

在pH值為5.0，加酶量為210 U/g，超聲功率200 W，料液比為1∶25（g∶mL）條件下，考察超聲時(shí)間對(duì)芹菜中總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on total flavonoids yield

由圖6可知，在10～40 min范圍之內(nèi)，芹菜中總黃酮的得率隨超聲時(shí)間的增加而增大，并于40 min時(shí)達(dá)到最大，之后開始下降。這是因?yàn)檫m當(dāng)延長(zhǎng)超聲時(shí)間，對(duì)原料組織的破碎程度增強(qiáng)，可使溶質(zhì)在溶劑中充分?jǐn)U散，從而增加總黃酮得率。但長(zhǎng)時(shí)間的高溫和超聲波共同作用則破壞了部分提取物，導(dǎo)致檢測(cè)到的總黃酮減少。所以超聲時(shí)間選擇為40 min最佳。

2.7 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

以芹菜中總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇酶解pH值、加酶量、超聲功率、料液比、超聲時(shí)間5個(gè)因素作為考察因素，分別選取4個(gè)水平進(jìn)行L16（45）正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction technology optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，各試驗(yàn)因素對(duì)芹菜中總黃酮得率影響大小順序?yàn)榧用噶浚境晻r(shí)間＞超聲功率＞pH值＞料液比。采用超聲波-纖維素酶協(xié)同方法醇提芹菜中總黃酮的最優(yōu)組合為A2B3C4D3E4，即酶解pH值為4.0、加酶量210 U/g、超聲功率200 W、料液比1∶25（g∶mL）、超聲時(shí)間40 min。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，總黃酮得率為1.018 4%。

由表3可知，加酶量、超聲功率、超聲時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響極顯著，pH值對(duì)結(jié)果的影響顯著。料液比對(duì)結(jié)果的影響不顯著。

3 結(jié)論

單因素試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)表明，酶解pH值、加酶量、超聲功率、料液比、超聲時(shí)間對(duì)芹菜中總黃酮的得率均有不同程度的影響。正交試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)表明影響芹菜中黃酮提取的5個(gè)因素的主次關(guān)系為：加酶量＞超聲時(shí)間＞超聲功率＞酶解pH值＞料液比；采用超聲波-纖維素酶協(xié)同方法醇提芹菜中總黃酮的最優(yōu)工藝條件為酶解pH 值為4.0、加酶量210 U/g、超聲功率200 W、料液比1∶25（g∶mL）、超聲時(shí)間40 min。在此條件下，芹菜中總黃酮的得率可達(dá)到1.018 4%。

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